二十碳五烯酸玻璃体注射治疗糖尿病性视网膜病变的实验研究

董白霞，叶存喜，包永琴，姚一民，魏玉华，杨 欣

（河北医科大学第二医院眼科，河北 石家庄 050000）

二十碳五烯酸玻璃体注射治疗糖尿病性视网膜病变的实验研究

董白霞，叶存喜，包永琴，姚一民，魏玉华，杨 欣

（河北医科大学第二医院眼科，河北 石家庄 050000）

目的 探讨二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）治疗糖尿病性视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）是否有效。方法 链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）与血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）联合应用诱导产生增殖型糖尿病视网膜病变（proliferative diabetic retinopathy，PDR）动物模型24只。随机分为D组（背景期给药组）12只、E组（增殖前期给药组）8只、F组（增殖期给药组）4只，玻璃体注射EPA，应用眼底荧光血管造影（fluorescence fundus angiography，FFA）、CD105免疫组织化学光镜观察眼底病变及阳性血管内皮细胞的变化，并与前期建立的PDR动物模型进行比较。结果 FFA结果显示，E组给药后2周内效果最佳，而D组给药后8周内均有效，随时间延长药效不断增强；E组给药后6周时效果差于D组给药后2、4、8周时；与未用药组相比，在相同的病程时均未观察到视网膜新生血管。F组给药后仍可观察到视网膜新生血管形成，并且DR也没有明显减轻。CD 105免疫组织化学结果显示，相同的病程内，D组和E组未观察到CD 105阳性的视网膜血管内皮细胞，但F组仍观察到CD 105阳性血管内皮细胞。结论 EPA可以在DR背景期和增殖前期封闭VEGF受体flk-1，阻断DR的发展。

视网膜疾病；血管内皮生长因子类；荧光血管造影

目前尚缺乏安全、经济、有效的药物用于增殖性糖尿 病 性 视 网 膜 病 变 （proliferative diabetic retinopathy，PDR）的治疗。寻求此类药物已成为众多学者研究和关注的热点问题。二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）是人体正常饮食中不可缺少的不饱和脂肪酸，Yang等［1］研究证实，EPA可抑制体外培养的牛颈动脉内皮细胞增殖。我们前期研究证明，EPA可抑制体外培养的人血管内皮细胞增殖［2］。但有人认为EPA对糖尿病视网膜病变有促进作用［3］。因此，本研究选用已建立的PDR模型［4］，根据体外实验得出的有效 EPA浓度和剂量［2］，在糖尿病性视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）不同时期给予EPA治疗，观察EPA在不同时期给药的治疗效果，报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物来源、选择及分组：选择8周龄健康SD大鼠31只，雌雄各半，体质量180～250g，购自河北省实验动物中心。31只鼠腹腔注射链脲佐菌素

（streptozotocin，STZ）（60mg／kg，用0.01mol／L的枸橼酸盐缓冲液溶解、浓度为 10g／L），1周后测血糖（美国强生血糖仪）≥13.9mmol／L确定为糖尿病鼠［5］，之后每周测血糖 1次，血糖＜13.9mmol／L鼠淘汰出糖尿病组，共注射31只，成模24只，成模率为77.4%。24只糖尿病大鼠采用随机方法分为 3组。①D组（背景期给药组）12只，注射STZ后1个月时846复合麻醉剂（0.4mL／kg）肌内注射全麻后，双眼玻璃体注射血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）0.5μL（美国Sigma公司）＋EPA 0.5μL（美国Cayman公司）＋生理盐水1.0μL。②E组（增殖前期给药组）8只，注射STZ后1个月时846复合麻醉剂（0.4mL／kg）肌内注射全麻后，双眼玻璃体注射VEGF 0.5μL＋生理盐水1.5μL，2周后双眼玻璃体液射EPA 0.5μL＋生理盐水1.5μL。③F组（增殖期给药组）4只，注射STZ后1个月时846复合麻醉剂（0.4mL／kg）肌内注射全麻后，双眼玻璃体注射VEGF 0.5μL＋生理盐水1.5μL，4周后双眼玻璃体注射EPA 0.5μL＋生理盐水1.5μL。

1.2 实验方法

1.2.1 眼底荧光血管造影（fluorescence fundus angiography，FFA）检查：玻璃体注射VEGF后第2周（D1亚组）、4周（D2、E1亚组）、8周（D3亚、E2亚、F组）各选3只鼠846复合麻醉剂（0.4mL／kg）肌内注射全麻后20%荧光素钠0.1mL腹腔注射，行双眼FFA检查，观察眼底病变程度。

1.2.2 视网膜组织病理学观察：每组3只动物FFA后，左侧颈动脉注射碳素墨汁后处死，摘除左眼球做组织切片，观察其视网膜微血管对碳素颗粒的渗漏程度；摘除右眼球做组织切片，行CD105免疫组织化学染色，观察有无增殖的新生血管内皮细胞。

2 结 果

2.1 FFA造影结果：D1组3只鼠FFA可见背景荧光增强，其中2只鼠可见视网膜出血（图1）；D2组3只鼠均可见背景荧光增强，其中2只鼠出现视网膜大血管扭曲变形和毛细血管扩张，1只鼠出现了视网膜内出血（图 2），未观察到视网膜新生血管；D3组3只鼠可观察到血管荧光素渗漏，无 1例观察到视网膜新生血管。E1组中 1只可见到视网膜大血管扭曲和毛细血管扩张、渗漏，2只鼠观察到背景荧光的增强；E2组3只鼠均可观察到视网膜出血、无1例观察到视网膜新生血管。F组3只鼠均观察到背景荧光的增强和视网膜内出血（图3，4），有 1只发现了视网膜新生血管（图5）。

2.2 视网膜组织病理学观察：光镜观察视网膜血管渗漏情况及免疫组织化学CD 105标记视网膜新生血管。D1组中2只鼠观察到典型的微血管碳素颗粒渗漏；3只鼠视网膜切片CD 105免疫组织化学染色均为阴性。D2组中1只鼠可观察到神经节细胞层大血管有碳素颗粒的渗漏；3只鼠视网膜切片CD105免疫组织化学染色均为阴性。D3组中均未观察到典型的微血管碳素颗粒渗漏；3只鼠视网膜切片CD 105免疫组织化学染色均为阴性。E1组中1只鼠可观察到典型的微血管碳素颗粒渗漏；3只鼠视网膜切片 CD 105免疫组织化学染色均为阴性。E2组，1只鼠可观察到典型的微血管碳素颗粒渗漏；3只鼠视网膜切片CD105免疫组织化学染色均为阴性。F组，3只鼠均观察到典型的微血管碳素颗粒渗漏；1只鼠视网膜切片CD105免疫组织化学染色为阳性，观察到视网膜前膜（图6）。

3 讨 论

随着糖尿病患者数量在世界范围内的与日俱增，DR已经成为生后最常见的致盲原因。90%以上的糖尿病患者最终会发生视网膜病变，其中 1型糖尿病患者中有60%、2型糖尿病患者中有20%会发展为PDR［6］。由于目前的治疗方法——光凝和玻璃体切除术势必会带来损害并且只在短期内有效，考虑到糖尿病患者的数量近年来持续增加，探索新的治疗方法迫在眉睫。

VEGF是造成DR新生血管形成的关键性因子，阻断其作用理论上可以抑制DR的发生和发展。目前在脉络膜新生血管性疾病的研究中已有3种药物应用于临床研究阶段，即 Macugen、Lucentis、Avastin。上述3种药物价格昂贵，均属于VEGF抗体类药物，可否用于治疗视网膜的新生血管性疾病尚有争议。

EPA作为VEGF受体 flk-1的封闭剂［7］，理论上可以达到阻断DR的效果［8］；另外，它还是人体中所必须的一种不饱和脂肪酸，广泛存在于深海鱼油中，对生物体无毒、无不良反应，开发前景广阔。近年来，EPA受到越来越多国外学者的关注。已有研究［1］表明，EPA在体内可以抑制肿瘤的生长和转移，在体外对VEGF诱导的牛颈动脉内皮细胞增殖有抑制作用，故其在体内抑制肿瘤生长的机制之一有可能是选择性抑制VEGF受体flk-1，从而抑制肿瘤的新生血管形成。我们的研究结果也表明，当EPA浓度达到0.15g／L时，可以抑制体外培养的人血管内皮细胞的增殖［2］。但对于EPA体内应用对DR的治疗作用尚存在争议［3］。因此，我们研究了EPA体内应用对DR的作用。

从本实验FFA结果与前期研究［4］结果比较来看，D1组3只鼠（3／3）FFA可见背景荧光增强，其中2只鼠（2／3）可见视网膜出血，与前期研究中相同病程未治疗组（C1组）发生视网膜出血的概率相同；D2组3只鼠均可见背景荧光增强，其中2只鼠（2／3）出现视网膜大血管扭曲变形和毛细血管扩张，1只鼠（1／3）出现了视网膜内出血，可见视网膜出血的发生率比C1、D1组的发生率降低了，而视网膜血管扭曲变形和毛细血管扩张这种比出血轻微的病变发生率增加了，说明DR的病情延缓了；未观察到视网膜新生血管，说明EPA治疗组在注射VEGF后4周仍未发生增殖性的病变。D3组3只鼠（3／3）可观察到血管荧光素渗漏，但无1例观察到视网膜新生血管，既无增殖性病变的发生，又较D1、D2组病变减轻。上述情况表明，背景期治疗可以延缓背景期DR的病变进展，给药后8周效果优于4周，4周时又优于2周，同时阻止了增殖性病变的发生。E1组1只鼠（1／3）可见到视网膜大血管扭曲和毛细血管扩张、渗漏，而无1例观察到视网膜出血，说明E1组DR病变比D1组减轻；2只鼠（2／3）观察到背景荧光的增强，较D1组发生率（3／3）降低；也就是说，增殖前期治疗在给药后2周内DR的病变程度较背景期治疗组明显减轻；D2组有 1例出血，E1组无1例出血，仅有1只鼠出现视网膜大血管扭曲和毛细血管扩张、渗漏；E1组2只鼠背景荧光增强，发生率低于D2组（3／3）。上述结果表明，增殖前期治疗组注射VEGF后4周不仅没有发生前期研究中相同病程未治疗组（C2组）的新生血管，而且DR病变程度也轻于D2组（背景期治疗组注射VEGF后4周）；E2组3只鼠均可观察到视网膜出血（3／3），无 1例观察到视网膜新生血管；虽未出现增殖性病变，但BDR病变的程度较D1、D2、D3、E1组重。说明增殖前期治疗组在给药后6周时的效果已明显减退，差于同期给药后 2周和背景期给药后 2、4、8周的效果。由此可见，增殖前期治疗组给药后的 2周内EPA作用效果最明显，而在背景期治疗组给药后8周内均有效，随时间延长效果增强，分析原因可能是大鼠玻璃体为不液化玻璃体，药物进入玻璃体后完全吸收所需时间长，故出现上述现象；而在增殖前期给药组中，由于此阶段VEGF水平高，需要足够的药物来封闭受体，所以同样剂量的EPA被充分消耗，才会出现在给药后6周时作用较差、但仍有效的结果。F组3只鼠（3／3）均观察到背景荧光的增强和视网膜内出血，有1只（1／3）发现了视网膜新生血管。表明视网膜出血的发生率在F组增加，还有新生血管出现，说明增殖期治疗组已有的PDR不能逆转，非PDR的发展也无减轻，这种结果与EPA是VEGF受体封闭剂有关。

其次，从光镜观察视网膜血管渗漏情况及免疫组织化学CD 105标记视网膜新生血管的情况来看，D1组2只鼠观察到典型的微血管碳素颗粒渗漏D2组1只鼠可观察到神经节细胞层大血管碳素颗粒的渗漏，D3组均未观察到典型的微血管碳素颗粒渗漏。说明随给药后时间的延长，DR病变程度在减轻，与FFA观察到的结果一致；E1组1只鼠可观察到典型的微血管碳素颗粒渗漏，E2组1只鼠可观察到典型的微血管碳素颗粒渗漏，2组与C1组比较均例数减少。说明治疗有效，E1和E2组比较在视网膜血管对碳素颗粒的渗漏上病变无减轻或加重，与FFA结果有出入，考虑是否与样本例数少有关。上述结果更进一步印证了FFA得出的结论：不论在增殖前期治疗还是在背景期治疗均能减轻BDR的病变；背景期治疗效果随时间的延长而渐好，而增殖前期治疗后2周时效果明显，6周时效果减退。各组CD105免疫组织化学结果均呈阴性，表明背景期和增殖前期给予EPA玻璃体注射治疗DR，均有效地阻止了PDR的发生。F组3只鼠均观察到典型的微血管碳素颗粒渗漏，1只鼠视网膜切片CD105免疫组织化学染色为阳性，观察到视网膜前膜，与FFA结果一致，从而进一步印证了FFA的结果。

综上所述，EPA对临床可见的DR血管增殖性病变存在着确切的治疗作用，不同时期给予EPA治疗的效果不同：在背景期给药后2、4、8周时，随时间的延长，对DR的治疗效果越来越明显，并能阻止增殖性血管病变的发生；在增殖前期给药后2周时，对减轻DR背景期病变的治疗效果优于 6周时，同样能阻止增殖性血管病变的发生。增殖期给予EPA治疗后不能阻止PDR血管性病变进展。（本文图见封二）

［1］YANG SP，MORITA I，MUROTA SI.Eicosapentaenoic acid attenuates vascular endothelial growth factor-induced proliferation via inhibiting Flk-1 receptor expression in bovine carotid artery endothelial cells［J］.J Cell Physiol，1998，176（2）：342－349.

［2］董白霞，马景学，叶存喜，等.二十碳五烯酸对体外培养的人血管内皮细胞增殖抑制效应的研究［J］.中华眼科杂志，2007，43（8）：726－733.

［3］HAMMES HP，WEISS A，FÜHRER D，et al.Acceleration of experimental diabetic retinopathy in the rat by omega-3 fatty acids［J］.Diabetologia，1996，39（3）：251－255.

［4］董白霞，马景学，叶存喜，等.增殖型糖尿病性视网膜病变动物模型的建立［J］.第三军医大学学报，2012，34（12）：1218－1222.

［5］BARBER AJ，ANTONETTI DA.Mapping the blood vessels with paracellular permeability in the retinas of diabetic rats［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2003，44（12）：5410－5416.

［6］RAKOCZY PE，BRANKOV M，FONCECA A，et al.Enhanced recombinant adeno-associated virus-mediated vascular endothelial growth factor expression in the adult mouse retina：a potential model for diabetic retinopathy［J］.Diabetes，2003，52（3）：857－863.

［7］MORITA I.Regulation of angiogenesis-expression of VEGF receptors［J］.Hum Cell，1998，11（4）：215－220.

［8］OZAKI H，SEO MS，OZAKI K，et al.Blockade of vascular endothelial cell growth factor receptor signaling is sufficient to completely prevent retinal neovascularization［J］.Am J Pathol，2000，156（2）：697－707.

（本文编辑：许卓文）

本刊全面执行国家有关期刊编辑出版规范化标准化的说明

根据国家有关科技期刊编辑出版规范化标准化（国家标准）的规定，本刊自2011年第32卷第8期在原有认真贯彻执行国家标准规定的基础上，进一步全面执行国家的最新标准和规定。因此，敬请广大欲投本刊的作者在投稿前多加留意本刊在众多细小地方的改变，尽力使自己的文稿符合国家标准和规范，以提高投稿的成功率。

《河北医科大学学报》编辑部

IN VIVORESEARCH ON TREATMENT OF PROLIFERATIVE DIABETIC RETINOPATHY BY EICOSAPENTAENOIC ACID INTRAVITREOUSLY

DONG Baixia，YE Cunxi，BAO Yongqin，YAO Yimin，WEI Yuhua，YANG Xin
（Department of Ophthalmology，the Second Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang050000，China）

ObjectiveTo identify the utility of eicosapentaenoic acid（EPA）on diabetic retinopathy（DR）in vivo.MethodsProliferative diabetic retinopathy（PDR）Sprague-Dawley rat（n＝24）was induced by application of streptozotocin associated with vascular endothelial growth factor（VEGF）.Sprague-Dawley rats were randomly divided into D group（n＝12）representing medication administration group at background DR stage，E group（n＝ 8）representing medication administration group at pre-proliferation DR stage，F group（n＝4）representing medication administration group at proliferation DR stage，then EPA was injected intravitreously.Fundus pathological changes were observed by fluorescence fundus angiography（FFA），CD105 positive retinal vascular endothelial cells were observed by microscope with immunohistochemistry technique.The results were compared with diabetic rat models established in our prior study.ResultsFFA demonstrated the best effect in E group in two weeks after EPAinjection，whereas effective and augmented time-dependently in D group during eight weeks after EPA injection.In six weeks after EPA injection in E group，the effect decreased obviously as compared with that 2，4，8 weeks after EPA injection in D group.As compared with nonmedication group，retinal neovascularization was not detected at the same course of this disease.Retinal neovascularization was also detected and diabetic retinopathy was not relieved in EPA injected eyes in F group.CD105 immunohistochemistry described there were no CD105 positive vascular endothelial cells at the same course of disease in D and E group.But CD105 positive cells were still observed in F group.ConclusionEPA can suppress DR development by blocking VEGF receptor flk-1.

retinal diseases；vascular endothelial growth factors；fluorescein angiography

R774.1

A

1007-3205（2014）10-1148-04

2014－02－22；

2014－04－02

河北医科大学第二医院院基金资助项目（2h1200601）

董白霞（1975－），女，河北河间人，河北医科大学第二医院副主任医师，医学博士，从事眼外伤、眼底病诊治研究。

10.3969／j.issn.1007-3205.2014.10.010