大分子物质对中药注射剂的安全性影响

柯 瑾， 张陆勇， 殷 华， 侯肖霖， 吕小满， 段为钢*

(1.云南中医学院中医药学分子生物学重点实验室，云南 昆明 650500； 2.中国药科大学新药筛选中心，江苏 南京 210009)

从第一支中药注射剂(Chinese Materia Medica injection，CMMI)“暴泼利尔”(柴胡注射液)问世至今，中药注射剂的发展经历半个多世纪[1]。中药注射剂大多根据其口服制剂上升而来，功效与其口服剂相似。随着中药注射剂品种的增多和临床的广泛应用，其疗效基本得到业界认可，但暴露出的安全性问题依然不容乐观[2]。中药注射剂安全性问题背后均存在相应的物质基础，根据前期分析，提出中药注射剂残留的微量大分子物质如蛋白质、缩合鞣质等可能是导致中药注射剂安全性的重要原因[3-6]。在这一观点的指导下，本实验以上市的清开灵注射液和双黄连注射液为例，从物质基础和疗效毒性方面考察去除大分子中药注射剂质量是否得到明显提高。

1 材料方法

1.1 一般材料 HPLC系统型号为安捷伦1100，由安捷伦科技有限公司生产，凝胶成像系统ChemiDoc RX为美国Bio-Rad公司产品，AB204-S电子分析天平为Mettler-Toledo公司产品，Cent 5415D高速离心机为德国Eppendorf公司产品，UV-1600型紫外可见分光光度计为北京瑞利分析仪器公司产品，TECAN多功能酶标仪(Infinity 200 pro+)为奥地利TECAN公司产品。电子红外耳温计(IRT 4520型)符合医用标准，产自美国Kaz USA. Inc.公司。

所用的水为MilliPore超纯水系统制得，符合三蒸水标准。3 k、10 k、30 k分子筛(超滤管)为MilliPore公司产品。清开灵注射液(批号100327.2)和双黄连注射液(批号20100324)均从市场购得，符合《中国药典》规定。

1.2 去大分子中药注射剂的制备 将中药注射剂加入到截留大分子物质的超滤管中，于4 ℃ 3 000 r/min离心获得超滤，滤液即为去大分子中药注射剂，同时也获得富含大分子中药注射液(上层截留液)。操作过程按照无菌操作进行，获得的样品保存在4 ℃或-20 ℃。注射液的固体物测定采用冷冻干燥称重法进行。精取1 mL样品，冻干至恒定质量后用分析天平称定质量计算各样品的固体物含有量。

1.3 指纹图谱检测 清开灵注射液的指纹图谱检测按照文献[7]条件进行，双黄连注射液的指纹图谱检测按照文献[8]条件进行。进样量为20 μL。以原始注射液为参照，计算各指纹峰的相对峰面积变化和总峰面积变化。

1.4 外观质量检测 将获得的去大分子注射液和富含大分子注射液装载在一次性无菌透明塑料试管(10 mL)中，将装有注射液的试管按一定顺序摆放在试管架上，在自然照明充足的条件下进行拍照，观察各试管颜色变化。另取各样品30 μL，加入到透明384孔板中，置于TECAN多功能酶标仪扫描400～800 nm的吸收光谱变化。

1.5 清热作用检测 清开灵注射液和双黄连注射液均具有清热作用。参照文献方法[9]，选用符合药典规定[10]的家兔复制脂多糖(LPS)家兔发热模型。每只家兔经耳缘静脉注射0.5 μg/kg的LPS(1 μg/mL，用注射用生理盐水配置)，注射后1 min同耳注射生理盐水或注射液原液或去大分子注射液，用红外耳温计记录注射LPS前家兔的耳温，注射LPS后每0.5 h记录另一耳的耳温。以注射LPS前的耳温为参考，计算注射LPS后家兔耳温的变化。

1.6 一般毒性检查和过敏毒性检查 一般毒性检查按照《中国药典》2010年版一部附录91[10]进行，过敏毒性检查按照《中国药典》2010年版一部附录92[11]进行。

2 结果

2.1 去大分子中药注射剂的指纹图谱无明显变化 清开灵注射液原液的指纹图谱与文献[7]相似，有4个较明显的峰，色谱图参见图1。将这4个色谱峰进行峰面积积分，以原液的对应峰为参照，计算去大分子注射液的相对峰面积，结果参见表1。将原液色谱图的总峰面积为参照，计算去大分子注射液的总的相对峰面积。

图1 清开灵注射液指纹图谱

双黄连注射液原液的指纹图谱与文献[8]相似，有6个较明显的峰，色谱图参见图2。将这6个色谱峰进行峰面积积分，以原液的对应峰为参照，计算去大分子注射液的相对峰面积，结果参见表1。将原液出峰的总峰面积为参照，计算去大分子注射液的总的相对峰面积，结果参见表2。

表1 清开灵注射液和双黄连注射液主要峰峰面积变化

表2 两种中药注射液去大分子物质和总峰面积变化

图2 双黄连注射液指纹图谱

结果表明，两种中药注射液去除大分子物质后，指纹图谱未见质的改变，但3 k分子筛选处理的单个峰面积变化较大。结合单个峰面积(表1)和总峰面积(表2)变化，得知截留去除10 k分子量后获得的中药注射剂的指纹图谱变化最小，相对总峰面积大于0.95(表2)。

2.2 去大分子后能明显提高中药注射剂的外观质量 将两种中药注射剂原液、去除大分子中药注射液和富含大分子注射液装在10 mL透明塑料试管中，排列在试管架上拍照，参见图3。各截留液来自4倍体积的原液。图3结果表明，滤过液的颜色均较原液浅，以3 k滤过液颜色最浅；而截留液以3 k截留液(富含大分子)颜色最深。可见光谱扫描结果(图4)也证明去除大分子物质后能改善中药注射剂外观质量。

2.3 去大分子中药注射剂主要疗效无明显下降

2.3.1 去大分子清开灵注射液的清热试验结果 0.5 μg/kg的LPS能诱发家兔发热，约1 h到高峰，维持约4 h，4 h后体温趋向恢复。清开灵注射液原液和去大分子注射液均有一定的体温降低作用，并有大体的量效相关性。经多因素方差分析，去大分子注射液的解热作用总体上略优于原注射液(P<0.05，双因素方差分析)，参见图5。

2.3.2 去大分子双黄连注射液与原注射液的清热试验结果 0.5 μg/kg的LPS能诱发家兔发热，约1.5 h到高峰，维持约3.5 h，随后体温趋向恢复。双黄连注射液原液与去大分子注射液均有一定的降体温作用(P<0.05)。去大分子注射液的解热作用不低于原注射液，参见图6。

2.4 去大分子中药注射液的安全性

2.4.1 清开灵注射液去大分子后安全性提高试验结果 按照《中国药典》2010年版一部附录91[10]要求配制以上7种来自清开灵注射液的样品，取符合要求的35只小鼠随机分为7组，每只小鼠腹腔注射0.5 mL，观察20 min，结果发现注射清开灵注射液原液、清开灵注射液10 k分子筛滤液、清开灵注射液30 k分子筛滤液样品的小鼠未见明显变化，而注射了清开灵注射液10 k分子筛截留液(源自10倍体积原液，固体物含有量0.062 2 g/mL)和30 k分子筛截留液(源自10倍体积原液，固体物含有量0.051 6 g/mL)样品的小鼠分别有5、4只发生扭体反应。表明富含大分子组分中药注射剂的安全性较低，从而间接表明去除大分子物质后的注射剂安全性得到提高。因当前实验只能将3 k截留液浓缩4倍(相当于从100 mL原液截滤制备25 mL截留液)，未观察到阳性结果。

从左至右依次为原液、3 k滤过液、10 k滤过液、30 k滤过液、3 k截留液、10 k截留液和30 k截留液；截留液均来自4被体积的原液

Q0.原液 Q1.3 k滤过液 Q2.10 k滤过液 Q3.30 k滤过液 S0.原液 S1.3 k滤过液 S2.10 k滤过液 S3.30 k滤过液

注：NS为生理盐水，给药量1 mL/kg；“清开灵”为清开灵注射液的原液；“处理”为10 k分子筛去大分子清开灵注射液。0.75、1.5、3 mL/kg分别指给药体积。

注：NS为生理盐水；“双黄连原”为双黄连注射液原液；“双黄连去”为10 k分子筛去大分子双黄连注射液。给药体积：1 mL/kg。

2.4.2 双黄连注射液去大分子后安全性提高试验结果 按照《中国药典》2010年版一部附录92[10]进行过敏反应检查。按照附录92要求配制以上4种来自双黄连注射液的样品，取符合要求的24只豚鼠随机分为4组，每只豚鼠隔天腹腔注射0.5 mL，共注射3次，以后正常饲养。第14天静脉注射以上样品各0.5 mL，结果30 min内发现注射双黄连注射液原液、双黄连注射液10 k分子筛滤液样品的豚鼠未见明显变化，而注射了双黄连注射液10 k分子筛截留液(源自10倍体积原液，固体物含有量0.026 6 g/mL)和双黄连注射液30 k分子筛截留液(源自10倍体积原液，固体物含有量0.023 1 g/mL)样品的豚鼠分别有3只呈现明显的过敏反应(竖毛、发抖)。表明富含大分子组分中药注射剂的安全性较低，易导致过敏反应，从而间接表明去除大分子物质后的注射剂安全性得到提高。

3 讨论

近年来，中药注射剂的安全性是业界关注的主要问题之一。尽管中药注射剂的安全性问题的解决是一个系统工程，涉及到标准、生产、流通和使用等环节[11-14]；但根据中药注射剂现阶段的生产特点和标准要求，我们认为其核心环节应该是标准制定环节和生产环节[15-16]。由于标准与生产直接相关，因此中药注射剂的安全性问题本质上是生产方面的质量问题。中药注射剂的安全性是有物质基础的[4]，根据前期分析，现阶段首要控制的就是中药注射剂的大分子物质。根据此指导思想，我们采用分子筛处理两种以往市场流通较多的两个品种，将获得的去大分子注射液和富含大分子注射液分别进行试验，结果表明通过一定分子筛处理，可以在保证疗效的前提下提高其安全性。

清开灵注射液和双黄连注射液均具有清热解毒之功效，临床用量较大，也是引发安全性问题频次较高的注射剂[15，16]。前期研究表明，该实验所用的两种注射液含有微量大分子(蛋白质和缩合鞣质)[5, 17-19]。本研究发现去除一定大分子物质后，注射剂的指纹图谱会发生改变[5，19-21]，截留分子量越小，对指纹图谱的影响越大。理论上，分子量大于3 000的成分不可能成为中药注射剂的活性成分，截留3 k分子量获得的新注射液应当有更高的安全性，但由于对指纹图谱的改变较大，提示可能严重改变了中药注射剂的物质基础，从而严重干扰疗效。由此推测，截留分子不宜过小。根据我们的研究结果，截留分子量在10k左右值得推荐，因为指纹图谱各峰的改变量较小，改变总量在5%以内，而且疗效(清热作用)基本不变或略有提高，但安全性却明显提高。

中药注射剂安全性提高的直接证据很难获得，因为上市注射剂是符合药典规定的，采用药典方法很难直接证明其安全性更高。本研究则采用“反证法”证明之，即：根据“大分子不是传统意义上中药注射剂的有效成分”这一观点，采用分子筛富集中药注射剂中的大分子物质，证明富集的大分子物质具有明显的“毒性”，从而间接证明去除大分子物质的中药注射剂则安全性明显提高。由于在实验中发现，3 k分子筛容易阻塞，很难将大分子物质富集到10倍，而且3 k分子筛处理的药液指纹图谱改变较大，因此没有考察此类富含大分子注射液的安全性和去大分子注射液的有效性或未获得较好结果。

根据原料来源，中药注射剂主要有两类，一类是以挥发油成分为主的注射液如鱼腥草注射液，另一类是以固体物为主的注射液。前者多采用水蒸气蒸馏法制得，理论上不含大分子物质(暂不考虑辅料)，后者多采用“水醇法”提取制得，理论上可以提取到微量大分子物质，实际上也能提取到大分子。本研究中的两种中药注射剂属于后者。对于“水醇法”提取制备的中药注射剂而言，本实验结果提示，去除一定的大分子物质，能够在保证有效性的前提下提高中药注射剂的安全性。

参考文献：

[1] 施怀生, 冯俊婵. 中药注射液创制考源[J]. 中华医史杂志, 1995, 25(2): 107.

[2] 徐 春. 关注中药注射剂的不良反应[J]. 中国现代药物应用, 2009, 3(4): 302-304.

[3] 段为钢. 中药注射剂安全性的技术思考[J]. 云南中医学院学报, 2009, 32(6): 12-13.

[4] 段为钢, 李奇峰, 柯 瑾. 中药注射剂有效性及“毒性”的物质基础分析[J]. 医学与哲学, 2011, 32(8): 56-57, 60.

[5] 段为钢, 柯 瑾, 李奇峰, 等. 蛋白质包被PVDF膜吸附法检查中药注射剂缩合鞣质[J]. 中成药, 2011, 33(11): 80-83.

[6] 段为钢, 张陆勇. 提高中药注射剂安全性的技术策略[J]. 中成药, 2012, 11(34): 2201-2205.

[7] 王志红, 赵绪元, 姚金成. 清开灵注射液指纹图谱的HPLC研究[J]. 中华中医药学刊, 2008, 26(4): 868-870.

[8] 李 方, 姜文红, 刘丽娟, 等. 注射用双黄连(冻干)指纹图谱的建立及其在质量控制中的应用[J]. 中成药, 2007, 29(8): 1196-1198.

[9] 李 婷, 杨 骏, 张 彤, 等. 柴胡葛根有效部位对脂多糖诱导家兔发热模型的解热作用研究[J]. 中成药, 2012, 34(2): 221-225.

[10] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典：2010年版一部[S]. 北京：中国医药科技出版社，2010：附录75-附录92.

[11] 刘桂林, 张韻慧, 王生田, 等. 中药注射剂安全性问题分析及对策[J]. 中草药, 2009, 40(11): 1-3.

[12] 熊兴江, 王 阶, 何庆勇. 中药注射剂应用现状及安全性问题与对策[J]. 中西医结合学报, 2010, 8(4): 307-311.

[13] 郑 慧, 杨丽霞, 薛世萍, 等. 中药注射剂安全性问题及对策[J]. 中国中医药信息杂志, 2012, 19(1): 99-100.

[14] 冯宇飞, 吕邵娃, 王艳宏, 等. 中药注射剂安全性问题分析及对策[J]. 中国实验方剂学杂志, 2011, 11(9): 278-281.

[15] 马 辉, 金 丹, 耿凤英, 等. 1190例中药注射剂不良反应报告分析[J]. 中国实用医药, 2009, 4(20): 8-10.

[16] 张惠霞, 陈建玉, 宋 成. 3 414 例中药注射剂不良反应分析[J]. 药物警戒, 2006, 3(4): 232-235.

[17] 李奇峰, 柯 瑾, 段为钢, 等. PVDF膜吸附染色法检测中药注射剂微量蛋白[J]. 云南中医学院学报, 2010, 33(6): 43-46.

[18] Duan W, Que L, Ke J,etal. Detection of trace protein in Chinese materia medica injections by soaking PVDF membrane[C]. RSETE 2011-proceedings, Newyork, USA: the Institute of Electrical and Electronics Engineers (IEEE) , Inc., 2011: 6718-6720.

[19] Duan W, Li Q, KE J. Detection of trace protein in Chinese materia medica injections by use of polyvinylidene fluoride membrane[C]. CEPPH 2011-Proceedings, Irvine, CA, USA: Scientific Research Publishing (SRP), Inc., 2011: 19-21.