西藏绵头雪兔子提取物对果蝇肠道免疫的影响

朱彩霞， 王 超， 金丽华*

(1.东北林业大学 生命科学学院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.西藏大学农牧学院，西藏 林芝 860000)

绵头雪兔子SaussurealanicepsHand.-Mazz. 为菊科风毛菊属植物，又名绵头雪莲花、麦朵刚拉(西藏)，具有解毒除湿之功效，用于治疗风湿痹症、通经、癫痫等[1]。近年来，国内外有研究资料表明，绵头雪兔子具有消炎止痛，抗氧化，清除自由基等作用[2-4]。

肠道黏膜除了具有消化吸收功能外，还能够保护宿主免受病原微生物的入侵，是菌群与宿主免疫系统的调节者。当果蝇肠道受到外界环境刺激时，其肠道上皮细胞会对内部和外部因子做出应答，以维持其肠道内环境稳态。果蝇是研究昆虫和人类肠道免疫的重要模式生物，利用果蝇研究中草药对肠道免疫的作用，可以较快而深入地了解中草药的功效。

本实验利用多种病原微生物、炎症离子和金属离子等刺激因子喂食果蝇，通过果蝇生存率的变化、肠道上皮细胞及形态学变化来分析绵头雪兔子提取物对果蝇肠道免疫功能的影响，以期为绵头雪兔子在免疫功能方面的研究和进一步开发利用提供科学依据。

1 材料

1.1 药材与试剂 绵头雪兔子来自西藏那曲地区，依据《西藏植物志》[5]鉴定。 NaCl和SDS购自Amresco；KAl(SO4)2购自Sigma公司；胰蛋白胨和酵母提取物购自Oxoid公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 果蝇与菌种 野生型黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster) W1118为实验室保存，培养温度 (25±1) ℃、相对湿度60%～70%。白僵菌(Beauveriabassiana)为实验室保存；绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)由青岛农业大学单虎教授提供。

1.3 仪器 5417R型低温离心机 (德国Eppendorf公司)；Vortex-Genie 2型涡旋振荡器 (美国Scientific Industries)；UV-1800型紫外分光光度计 (日本岛津公司)；SZ51型显微镜 (日本Olympus公司)；Axioskop 2 plus型荧光显微镜 (德国Zeiss公司)。

2 方法

2.1 绵头雪兔子提取液的制备 取绵头雪兔子20 g，剪碎，加入400 mL去离子水浸泡24 h，加热微沸3 h，过滤，再加入400 mL去离子水用同样的方法提取2次，合并3次提取的滤液并加热浓缩至200 mL，即得到质量浓度为0.1 g/mL (10%) 的绵头雪兔子提取液，置4 ℃保存备用。

2.2 果蝇培养基的配制 对照组的培养基配制方法参见文献[6]。其中实验组中加入与对照组去离子水等体积的绵头雪兔子提取液，实验组中绵头雪兔子的质量分数分别为2.5%和5%。

2.3 菌液的配制

2.3.1 细菌菌液的配制 绿脓杆菌(LB培养基，37 ℃) 接种到200 mL液体培养基中过夜扩大培养，将菌液4 000 r/min、25 ℃，离心10 min，弃上清，在沉淀中加入5%蔗糖溶液或含5%蔗糖的绵头雪兔子提取液。

2.3.2 白僵菌孢子液的制备 将白僵菌在LB固体培养基上培养7 d (25 ℃)，待其产孢后，刮取孢子加入到PBS中，充分振荡均匀，过滤，测定A600值，配制成A600值为40的孢子液 (含5%蔗糖)。

2.4 果蝇生存率 分别随机收集对照组和实验组羽化了3 ～ 5 d的果蝇，每组中雌雄果蝇各15只。对各组果蝇饥饿处理2 h后转移到放有5层滤纸的果蝇管中，分别加入致炎因子、细菌和孢子液等使滤纸充分润湿。每24 h更换1次滤纸并记录果蝇死亡数，每组实验重复3次。

2.5 免疫染色 分别随机收集对照组和实验组羽化了3 ～ 5 d的雌果蝇，连续处理NaCl 5 d或SDS 4 d，显微镜下提取8～10条果蝇肠道于PBS中，7-AAD染色30 min，多聚甲醛固定10 min，DAPI染色10 min，甘油封片后荧光显微镜下观察并拍照，每组实验重复3次。

2.6 肠道形态变化观察 收集羽化了3～5 d的雌果蝇，SDS处理后，显微镜下提取8～10条果蝇肠道于PBS中，显微镜下观察并拍照，每组实验重复3次。

2.7 统计学处理 采用Prism软件进行统计分析，组间差异采用单因素方差分析。

3 结果

3.1 病原微生物对果蝇生存率的影响 真菌白僵菌的孢子感染6 d后，对照组果蝇的生存率降到15.8%，而喂食2.5%和5%绵头雪兔子的实验组分别为26.7%和66.7%，与对照组相比分别提高了10.9%和50.9% (P<0.01) (图1A)。被革兰氏阴性菌绿脓杆菌感染时，实验组和对照组的生存率相似 (图1B)。这表明绵头雪兔子提取物可抵御真菌的感染，且随着浓度的增加抵御能力增强。

3.2 致炎离子和金属离子对果蝇生存率的影响 成体果蝇NaCl处理6 d后，对照组的生存率仅为7.6%，而喂食2.5%和5%绵头雪兔子的实验组分别为63.3%P<0.01 和53.3%P<0.02，提高了7.3倍和6倍 (图2A)。SDS处理后，喂食2.5%和5%绵头雪兔子的实验组生存率分别为45.6% (P< 0.1) 和75.6% (P< 0.01)，是对照组(14.0%) 的3.2倍和5.4倍，并且5%绵头雪兔子效果更为显著 (图2B)。另外，KAl(SO4)2处理果蝇6 d后，喂食5%绵头雪兔子可显著提高果蝇的生存率(P< 0.001)，其生存率88.9%是对照组41.1%的2.2倍，而喂食2.5%绵头雪兔子的实验组 (38.9%) 和对照组相似 (图2C)。此结果说明绵头雪兔子提取物可缓解致炎离子和金属离子引起的损伤，显著地提高了果蝇的生存率。

图1 绵头雪兔子提取物对病原体感染后果蝇生存率的影响

图2 绵头雪兔子提取物对致炎离子及金属离子处理后果蝇生存率的影响

3.3 分析果蝇肠道上皮细胞 为了进一步验证NaCl和SDS处理后绵头雪兔子提取物对果蝇生存率的影响，本实验利用7-AAD染色分析了肠道上皮细胞的死亡情况。结果表明，不管是NaCl还是SDS刺激，对照组的肠道上皮细胞均出现大量死亡，而喂食2.5%绵头雪兔子的实验组中肠道上皮细胞的死亡数量明显减少，结果见图3。

图3 绵头雪兔子提取物对NaCl(A)和SDS(B)处理后果蝇肠道上皮细胞的影响

3.4 分析果蝇肠道形态变化 对照组和实验组SDS (0.6%)处理后分析果蝇的肠道形态变化。首先，SDS处理4 d后分离肠道，比较肠道的长度。结果表明，SDS处理的对照组与只喂食蔗糖的果蝇肠道相比，长度明显缩短，而且在中肠和后肠连接处出现了明显的黑色素瘤。当喂食2.5%绵头雪兔子时，与对照组相比肠道长度明显增加，而且没有发现黑色素瘤，但是比只喂食蔗糖的果蝇肠道短一部分 (图4A)。其次，分析了SDS不同处理时间对果蝇肠道壁厚度的影响。随着处理时间的增加，对照组果蝇的肠道壁厚度逐渐变薄。而喂食2.5%绵头雪兔子的果蝇肠道壁厚度没有明显变化，SDS处理后的第4天和第6天，果蝇肠道壁厚度基本相似 (图4B)。这表明绵头雪兔子提取物可保护肠道上皮细胞免受SDS诱导的炎症损伤。

图4 绵头雪兔子提取物对SDS处理后果蝇肠道形态(A)和肠道壁厚度(B)的影响

4 讨论

绵头雪兔子含有芹菜素、紫丁香苷、β-谷甾醇、伞形花内酯、雪莲内酯等物质[7]。其中，芹菜素具有抗氧化、清除自由基、抗肿瘤和抗炎等作用[8-9]；紫丁香苷具有增强免疫力、抗氧化以及抗抑郁等作用[10-11]；β-谷甾醇是一种良好的抗氧化剂，具有很好的清除自由基的能力[12]。

肠道是人体内最大的免疫器官。果蝇与人类的肠道具有相似的结构和功能；肠道干细胞的分化机制也十分相似；同时癌基因与肿瘤基因在果蝇与人类之间也是高度保守的。所以，可以利用模式生物果蝇研究调控肠道免疫相关的中药及其复方。为了探讨绵头雪兔子对果蝇肠道免疫的影响，即其抵御病原微生物感染和抗炎的能力，本研究建立果蝇肠道免疫功能损伤模型，通过统计生存率、分析肠道上皮细胞死亡和观察肠道形态变化等来探讨绵头雪兔子的免疫调节功能。结果显示，绵头雪兔子可抵御真菌白僵菌的感染，而对细菌绿脓杆菌的感染没有保护作用。另外，绵头雪兔子可缓解NaCl和SDS引起的炎症反应，这可能是由于绵头雪兔子保护了肠道上皮细胞免受炎症的损伤，从而提高了肠黏膜的免疫功能。对于金属离子诱导的损伤，5%绵头雪兔子可提高KAl(SO4)2处理后果蝇的生存率，这可能是绵头雪兔子减弱了KAl(SO4)2引起的脂质过氧化反应[13]。只喂食5%蔗糖和绵头雪兔子提取物时果蝇6 d内的生存率没有发生变化，而且果蝇在2.5%和5%的绵头雪兔子培养基里的生长状态与正常培养基相同，这说明蔗糖和绵头雪兔子提取物对果蝇不会造成损伤。综上所述，绵头雪兔子可提高果蝇的肠道免疫功能，缓解病原微生物和炎症因子引起的损伤，此结果为绵头雪兔子的开发与利用提供了新思路。

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