人卵巢颗粒细胞上胰岛素/胰岛素样生长因子受体表达的相关性研究

梁莹 李淑贤 米梅艳 周莉 吴晓茜 雷灵梅

卵母细胞及其周围的颗粒细胞和卵泡液同处一个卵泡微环境中，卵母细胞、卵丘细胞、卵丘细胞、卵丘颗粒细胞以及壁层颗粒细胞之间彼此有着许多缝隙连接，并且交流信息，功能互相联系成为一个整体。在卵母细胞发育成熟和颗粒细胞分化过程中，卵泡内的这种细胞间的联系，尤其是局部的自分泌、旁分泌的细胞因子的作用，是非常重要的。所以，在卵母细胞质量的研究中，对颗粒细胞分泌的细胞因子的研究受到了广泛关注［1，2］。胰岛素/胰岛素样生长因子(insulin/insulin-like growth factor 1，INS/IGF-1)信号通路是卵巢内重要的信号通路之一［3-5］。本研究旨在检测人颗粒细胞上胰岛素受体(insulin receptor，INSR)和胰岛素样生长因子-1受体(insulin-like growth factor 1 receptor，IGF-1R)的表达，比较不同妊娠结局组别INSR的表达差异及其与血清性激素的关系，探讨颗粒细胞上INSR和IGF-1R的生理意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 石家庄市妇产医院生殖医学中心2010年9月至2011年6月接受IVF-ET治疗不孕症患者84例，年龄23～39岁，平均年龄(29.6±2.0)岁。按照妊娠结局分为妊娠组和未妊娠组。每组42例。妊娠组42例，年龄23～39岁，平均年龄(29.3±4.0)岁;未妊娠组42例，年龄24～39岁，平均(29.1±3.2)岁。2组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。该研究经石家庄市第四医院伦理委员会批准。

1.2 纳入及排除标准(1)纳入标准:①符合诊断标准;②基础促卵泡刺激素(Basal Follicle-stimulating Hormone，BFSH)＜10 mU/ml;③年龄 ＜40岁;④签订知情同意书。(2)排除标准:①子宫无妊娠能力或者严重躯体疾病不能妊娠;②接触致畸量的毒物、射线并处作用期;③有严重的精神疾病;④性传播疾病;⑤泌尿生殖系统炎症;⑥有吸毒等严重不良嗜好;⑦子宫内膜异位症。

1.3 治疗方法 常规长方案促排卵治疗。月经的第20天或者黄体中期给予醋酸曲普瑞林(Triptorelin Acetate，0.1mg/支，法国博福益普生，D22863)0.1 mg·支-1·d-1，皮下注射，14～18 d。当达到降调节标准时，即子宫内膜5 mm，血清雌二醇(E2)＜50 pg/ml后，给予重组人促卵泡激素(Gonal-F，果那芬，75 U/支，默克雪兰诺，AU002290)250～300 U/d，皮下注射，观察B超监测卵泡发育情况及血清黄体生成素(Luteinizing Hormone，LH)、雌二醇(Estradiol，E2)、孕酮(Progesterone，P)水平，当60%的优势卵泡直径≥18 mm时停药，于20∶00～21∶00给予重组绒促性素250 g(艾泽，250 g/支，默克雪兰诺，DA009256)，皮下注射，诱导卵泡成熟，36～38 h后经阴道超声引导下取卵。

1.4 方法及观察指标

1.4.1 颗粒细胞的提取:留取直径18～20 mm的优势卵泡的卵泡液，1 500 r/min离心10 min，加入PBS至5 ml制成混悬液。另取15 ml离心管，加入人淋巴细胞分离液5 ml，将混悬液缓慢加入淋巴细胞分离液的液面上，1 200 r/min离心20 min，吸取在两液面之间的颗粒细胞层，并且加入PBS 3 000 r/min离心5 min，下层即为壁颗粒细胞。加入2 ml Trizol液(invitrogen公司)完全裂解后置于-80℃冻存(用于实时荧光定量PCR)。

1.4.2 性激素的测定采用化学发光微粒子免疫测定法，美国ARCHITECT公司提供LH、E2、P试剂盒测定。按试剂说明书同批专人操作。

1.5 卵泡壁颗粒细胞INSR、IGF-1RmRNA表达采用实时荧光定量PCR法。Trizol(Invotrigen公司，美国)一步法提取颗粒细胞总RNA，取2 μg总RNA进行反转录。然后分别以人GAPDH、INSR、IGF-1R的特异性引物进行PCR反应。利用GenBank数据库中提供的基因序列，经GenBank BLAST进行引物序列同源性检测，用DNAman version 6软件设计，由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列如下:GAPDH-上游:5’-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3，GAPDH-下 游:5’-GCTTCACCACCTTCTTGATGTC-3’;INSR-上 游:5’-TGCCCACCATCTGTAAGT-3’，INSR-下游:5’-CGTCCAGGTAGAAGTTGCG-3’;IGF-1R-上游:5’-TGAACTTTCTCCCTCATCGG-3’，IGF-1R-下 游:5’-GCCAGCGTGTCTCTCAAAT-3’;应用ABI 7300型实时荧光定量PCR仪来进行扩增反应40个循环。INSR、IGF-1RmRNA表达量以2-△△CT来表示，其值为以INSR、IGF-1R mRNA表达量与GAPDH表达量的比值，再将对照组某某的量设为1，其余样本的数值与其相除，得到相对定量值。每个目的基因测定重复3次。

1.6 统计学分析 应用SPSS 13.0统计软件，计量资料以±s表示，采用t检验，计数资料比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组临床指标比较 妊娠组血清E2水平高于未妊娠组，差异有统计学意义(P＜0.05)。妊娠组优质胚胎数高于未妊娠组，差异有统计学意义。其余两组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

表1 2组HCG日血清LH、E2、P水平及获卵数、受精率和优质胚胎率的比较n=42

2.2 2组壁颗粒细胞INSR、IGF-1R mRNA表达比较

84例患者壁颗粒细胞上均有INSR、IGF-1RmRNA表达。妊娠组INSR、IGF-1R、表达高于未妊娠组，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

表2 2组壁颗粒细胞INSR、IGF-1RmRNA表达比较n=42，±s

表2 2组壁颗粒细胞INSR、IGF-1RmRNA表达比较n=42，±s

注:与未妊娠组比较，*P＜0.05

INSRmRNAIGF-1R mRNA妊娠组0.84±0.14*0.79±0.14组别*未妊娠组0.39±0.090.41±0.12

2.3 相关性分析INSR与IGF-1R呈正相关(r=0.712，P＜0.01);INSR、IGF-1R表达与血清LH、E2、P水平无相关性(r值分别为0.005、0.305、0.272、0.076、0.274、0.2992，P＞0.05)。

3 讨论

INS/IGF-1信号通路是卵巢内重要的信号通路之一。关于这一信号通路目前研究较多的是卵泡液，研究显示，卵泡液中IGF-1和IGFBP-1的浓度与卵母细胞的质量呈正相关［6］，血清和卵泡液中IGF/IGFBP的比率，妊娠女性比未妊娠者高［7］，提示这个比率是评估卵母细胞质量的有效参数。本研究对颗粒细胞上膜受体进行研究，发现颗粒细胞INSR、IGF-1R的表达妊娠组高于未妊娠组，证明卵泡内的INS/IGF-1信号通路是通过对颗粒细胞的调控影响卵母细胞发育的。INSR、IGF-1R两者具有相关性，提示两者在同一信号通路上，功能相关，而且INSR、IGF-1R与血清的性激素的水平无相关性，提示INSR、IGF-1R不直接受到性激素的调节。细胞膜受体表达的增加也增强IGF-1等信号因子的功能，因而与既往的研究结果［6，7］一致。因而颗粒细胞INSR表达的增加，可以增强insulin的功能促进卵泡内对葡萄糖的摄取，促进卵泡内糖酵解过程为卵泡发育及卵母细胞成熟提供能量。还有研究显示IGF-1及其受体对FSH刺激的颗粒细胞分泌雌激素的关键酶的调节也是非常重要的［8］。综上所述，本研究结果显示颗粒细胞上INSR、IGF-1R的表达可能对颗粒细胞的卵巢内糖酵解和分泌功能都具有重要的作用，从而影响卵母细胞的发育和成熟。

病理研究显示，多囊卵巢综合征多伴有胰岛素抵抗，在卵巢局部INS/IGF-1信号通路的异常，导致了多囊卵巢综合征患者卵子质量下降、局部的病理的形成。研究显示，高剂量的胰岛素会诱导颗粒细胞产生胰岛素抵抗，葡萄糖明显受影响，因而证明高胰岛素可以影响葡萄糖利用，削弱卵泡的糖酵解作用，减少能量的供应，从而影响卵泡生长成熟［9］。IGF-2在优势卵泡的卵泡液及颗粒细胞中的高表达，表明它在在卵泡发育和对优势卵泡成熟有重要作用［10］。IGF系统与高胰岛素密切相关，高胰岛素可以减少IGF结合蛋白(insulin likegrowth binding proteins，IGFBPs)合成，增加游离的IGF-1［11］，增多的游离IGF-1下调IGF-1受体表达。因为IGF-1受体通过葡萄糖转运蛋白8(glucose transporter 8，GLUT-8)通道促进糖吸收，所以IGF-1受体下调导致卵泡糖吸收障碍，发育障碍。而本研究通过对比颗粒细胞INSR、IGF-1R和妊娠的关系，直接证明了卵巢局部INS/IGF-1信号的异常影响了卵母细胞的质量，也与以上对多囊卵巢综合征卵巢病理的研究结论相一致，更有力的证明了INS/IGF-1信号在卵巢功能中的重要作用。

1 Wang Q，Sun QY.Evaluation of oocyte quality:morphological，cellular and molecular predictors.Reprod Fertil Dev，2007，19:1-12.

2 Revelli A，Delle Piane L，Casano S，et al.Follicular fluid content and oocyte quality:from single biochemical markers to metabolomics.Reprod Biol Endocrinol，2009，7:40.

3 Babitha V，Yadav VP，Chouhan VS，et，al.Luteinizing hormone，insulin like growth factor-1，and epidermal growth factor stimulate vascular endothelial growth factor production in cultured bubaline granulosa cells.Gen Comp Endocrinol.2013 Dec 17

4 Reverchon M，Cornuau M，Ramé C，et，al.Resistin decreases insulin-like growth factor I-induced steroid production and insulin-like growth factor I receptor signaling in human granulosa cells.Fertil Steril，2013，100:247-255.

5 朱亮，邢福，祺全松等.DHEA诱导SD大鼠PCOS模型LHR、INSR、AR基因甲基化的研究.生殖与避孕，2010，30:9-14.

6 Oosterhuis GJ，Vermes I，Lambalk CB，et al.Insulin-likegrowth factor(IGF)-I and IGF binding protein-3 concentra-tions in fluid from human stimulated follicles.Hum Reprod，1998，13:285-289.

7 Fried G，Remaeus K，Harlin J，et al.Inhibin B predictsoocyte number and the ratio IGF-I/IGFBP-1 may indicateoocyte quality during ovarian hyperstimulation for in vitrofertilization.J Assist Reprod Genet，2003，20:167-176.

8 Zhou P，Baumgarten SC，Wu Y，et al.IGF-I signaling is essential for FSH stimulation of AKT and steroidogenic genes in granulosa cells.Mol Endocrinol，2013，27:511-523.

9 Dumesic D，Abbott D.Implications of polycystic ovary syndrome on oocyte development.Sem in Reprod Med，2008，26:53-61.

10 Velazquez MA，Hermann D，Kues WA，et al.Increased apoptosis in bovine blastocysts exposed to high levels of IGF1 is not associated with downregulation of the IGF1receptor.Reproduction，2010，141:91-103.

11 Eng GS，Sheridan R，Awyman A，et al.AMP kinase activation increases glucose uptake，decreases apoptosis，and improves pregnancy outcome in embryos exposed to high IGF-I concentrations.Diabetes，2007，56:2228-2234.