甲型流感病毒FM1株诱导感染不同鼠龄小鼠肺炎模型比较

胡楠楠，王雪峰，岳志军，南春红，朱万青，暴春晓

流感一词来源于拉丁语“influentia”的意大利语形式，意为“流行的、传染的”，2009-04以来，由H1N1引发的甲型流感病毒在世界范围内的流行引起了广泛的关注，并好发于儿童和老人，本研究基于此，通过甲型流感病毒FM1株诱导不同鼠龄肺炎，评价哪一鼠龄昆明种小鼠为甲型流感病毒理想模型。

1 材料与方法

1.1 病毒 甲型流感病毒鼠肺适应株A/FM1/47(H1N1 influenza virus,IV)，由中国预防医学科学研究院病毒研究所提供，冻存于辽宁中医药大学病毒室。解冻后经9日龄尼克白种鸡胚(SPF级，购买于辽宁益康生物制品厂)的尿囊腔接种培养传代后为FM1M9E2M1E3M2E4M1E5。微量血凝实验滴定效价，血凝效价1∶1 280者供实验用。

1.2 实验动物

1.2.1 用于甲型流感病毒对幼龄小鼠LD50测定的实验动物 昆明种幼龄小白鼠30只，清洁级，雌雄各半，3～4周龄，体质量12～14 g，由辽宁中医药大学实验动物中心提供。小鼠置于无病原体清洁笼内饲养，饲料和饮用水经高温高压消毒。

1.2.2 用于模型观察的实验动物 昆明种小白鼠150只，清洁级，雌雄各半，鼠龄均等，幼龄鼠选3～4周龄，体质量(12±2)g，成龄鼠选3月龄，体质量(30±5)g，老龄鼠选用20月龄，体质量(30±5)g，由辽宁中医药大学实验动物中心提供。小鼠置于无病原体清洁笼内饲养，饲料和饮用水经高温高压消毒。

1.3 主要仪器与试剂 BX50F4型系统生物显微镜(日本OLYPUS)；RM2135型精密转轮切片机(德国LEICA)；EG1150型石蜡包埋机(Leica)；LC-11型荧光定量PCR仪(ROCHE)；C232NWI型超低温冰箱(意大利indesit)；甲型流感病毒核酸检测试剂盒(中山大学达安基因股份有限公司，批号：2011004)；核酸提取试剂(中山大学达安基因股份有限公司，批号：20110603)；引物由宝生物工程(大连)有限公司合成，GAPDH:上游5'-GAC ATC AAG AAG GTG GTG AAG-3'，下游5＇-TGG AAA TTG TGA GGG AGA TGC-3',扩增特异片段长度为336 bp。IV:上游5'-GAG AAA GAA GTC CTT GTG C-3'，下游5＇-TCT ATC ATT CCA GTC CAT CCC-3',扩增特异片段长度为530 bp。

1.4 方法 将IV增毒后的新鲜尿囊液(血凝滴度1∶1 280)10倍系列稀释6个浓度(1×10-1～1×10-6)，将30只幼龄昆明种小鼠按随机数字表法分6组，每组5只。在乙醚麻醉下经鼻腔接种甲型流感病毒FM1株，每组接种同一个浓度(0.05 mL/只)；连续观察14 d，记录小鼠死亡情况，并进行死亡百分率统计，计算IV小鼠半数致死量(LD50)。另选取150只不同鼠龄昆明种小鼠按随机数字表法分为6组：幼龄模型组40只，成龄模型组40只，老龄模型组40只，幼龄正常组、成龄正常组、老龄正常组各10只。依照文献[1]用无水乙醚麻醉小鼠，每鼻孔15 LD50滴鼻IV液0.05 mL。不同鼠龄正常对照组在同等条件下接种等量不含病毒的生理盐水。

各组模型分别于造模后第3、5、7天，按随机数字表法抽取10只，麻醉后颈椎脱臼处死取材。无菌开胸，取出整个肺脏称肺质量计算肺湿质量，并计算湿质量肺指数(肺质量/体质量×100%)。后取左肺，4%多聚甲醛固定待做病理切片检查。根据文献[1]方法，对小鼠病毒性肺炎组织病理学进行评分。取右肺组织无菌处理，进行甲型流感病毒荧光定量RT-PCR检测。

1.5 荧光定量PCR(FQ-PCR)检测模型各组小鼠肺组织IV总RNA 采用离心柱法提取IV病毒核酸和PCR扩增，取50 mg鼠肺组织，加入200 μL生理盐水，加入200 μL的裂解工作液，标准操作，离心使用低温离心机，温育温度控制在72 ℃，得到病毒核酸溶液。取适量PCR反应管，每管加入IVA PCR反应液，于对应PCR反应管中分别加入处理后的阴性质控品、待检测标本核酸、IVA强阳性质控品、IVA临界阳性质控品各5 μL，8 000 r/min。扩增参数：50 ℃ 15 min，1个循环；95 ℃ 15 min，1个循环；94 ℃ 15 s，2个循环；58 ℃ 45 s，40个循环；40 ℃ 10 s，1个循环，结束后自动分析。

1.6 观察指标 动态观察小鼠生命状态：每天观察记录各组小鼠、皮毛色泽、饮食、活动情况和精神状态，定期测量体质量。分别于感染3、5、7 d，检测其肺湿质量、肺组织肉眼病理评分、肺组织病理切片以及肺组织FQ-PCR病毒载量检测。

2 结果

2.1 甲型IV株对幼龄小鼠LD50的测定 见表1。

表1 幼龄小鼠接种不同浓度IV后的死亡情况(n)

2.2 不同时间点各组小鼠一般状态观察 幼龄模型组死亡最多，其中接毒24 h内死亡2只，14 d内共死亡15只，在第5天达到死亡高峰，与其他组比较差异有统计学意义(P<0.05)。成龄模型组14 d内共死亡2只，其余小鼠表现活泼，反应灵敏，呼吸平稳，毛色光洁，鼻腔未见明显分泌物，无呼吸系统疾病的症状表现。老龄模型组14 d内死亡5只，解剖后观察肺组织炎症提示2只有轻度炎症，其他3只肺组织无改变。

2.3 不同时点各组小鼠肺指数评分与肺组织病理评分比较 见表2。

表2 不同时点各组小鼠肺指数比较±s，n=10)

表2结果表明，各年龄正常对照组小鼠在不同时点肺指数比较差异无统计学意义(P>0.05)。幼龄模型组肺指数最高，与幼龄正常对照组、成龄模型组及老龄模型组比较差异均有统计学意义(P<0.05)，感染第5天肺指数达到最高。

不同时点取小鼠肺组织(3组正常对照各取2只观察肺组织)，观察其外观病变程度。结果显示：各对照组小鼠在不同时点肺组织外观全肺野无病变，见图1(封三)；幼龄模型组肺组织病变最重，成龄模型组各时间点与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，与幼龄模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)，与老龄模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)；老龄模型组各时间点与其他组比较差异有统计学意义(P<0.05)，老龄模型组第5天肺组织病变有恢复的趋势。

2.4 各组小鼠不同时点肺组织病理改变 光镜下观察幼龄模型组：病变区内肺泡间隔明显增宽，血管扩张、充血，间质水肿伴大量炎症细胞浸润；气管管壁及其周围间质充血、水肿，可见炎性细胞浸润，肺泡腔内可见渗出液；符合肺炎病理表现，见图2～4(封三)。成龄模型组：气管管壁无充血、水肿，肺泡间隔无增宽，血管无扩张、充血，未见明显的炎性细胞的浸润。老龄模型组：造模后第5天气管管壁有充血、水肿，未见明显的炎性细胞的浸润。

2.5 各组小鼠肺组织不同时点小鼠肺组织FQ-PCR 见表3。

表3 各组小鼠肺组织不同时点小鼠肺组织FQ-±s，n=10)

表3结果表明，幼龄模型组病毒载量最多，第7天肺组织IV病毒载量达到高峰，病毒载量呈递增趋势，各时间点比较差异有统计学意义(P<0.05)；成龄鼠模型组在滴鼻接种第3天病毒载量最少，虽然在第5天有明显增高趋势，但第7天依然维持在第5天水平，第5、7天相比差异无统计学意义(P>0.05)。老龄鼠模型组在第3天时病毒载量最高，第5天明显升高，但第5、7天相比差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

选择复制人类感染流感病毒的动物模型，首先是要所复制的模型应尽可能的类似于人类感染流感病毒后的状况，设计动物模型时要遵循以下原则：相似性、重复性、可靠性、适用性和经济性[2]。小鼠模型能够进行防治流感病毒感染、药物免疫作用等方面的研究[3-5]。由于小鼠和人的亲缘关系较近，遗传学背景清楚，有其价廉、实验周期短、易于饲养等优点，许多疾病可以为此动物模型进行相关研究。

本研究依照文献[1，3]的方法,以IV鼠肺适应株滴鼻建立小鼠肺炎模型。通过滴鼻接种幼龄、成龄与老龄昆明种小鼠建立IV肺炎动物模型的对照实验研究，观察小鼠一般状态及存活只数，比较各组小鼠的不同时点肺指数与肺组织病理评分，测定小鼠肺组织中不同时点肺组织FQ-PCR。

结果显示，幼龄昆明种小鼠对甲型流感病毒FM1株更具有易感性，为甲型流感病毒FM1感染模型的最佳受试体，虽然结果中，老龄昆明种小鼠在接种后第3天也显示出了肺组织的病变，但是其组织中的流感病毒含量较少与幼龄鼠肺组织中的流感病毒含量有显著差异。故而以甲型流感病毒鼠肺适应株滴鼻建立小鼠肺炎模型，幼龄模型组流感病毒感染模型造模成功，成龄鼠、老龄鼠不能成功造模。该实验研究结果确证了幼龄昆明种小鼠对流感病毒的易感性，是甲型流感病毒FM1株诱导小鼠急性肺炎的理想模型。

[1] 殷震，刘景华.动物病毒学[M].北京：科技出版社,1997：89.

[2] 张春花，朱丹，刘华钢，等.流感病毒感染实验动物模型建立的研究进展[J].广西医科大学学报，2011，28(5)：808-811.

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(收稿日期：2014-04-03)