鹅去氧胆酸与熊去氧胆酸的合成工艺研究

张 飞，赵静国，赵蒙浩

(武汉轻工大学生物与制药工程学院，湖北 武汉 430023)

鹅去氧胆酸(chenodeoxycholic acid,CDCA)是动物体胆汁中的一种生化物质，临床上不仅用作溶解胆固醇类结石和纠正饱和胆汁的药物，还具有显著的平喘、抗炎、镇咳和祛痰作用，同时鹅去氧胆酸还是昂贵的熊去氧胆酸(ursodeoxycholic acid,UDCA)的合成原料[1]。熊去氧胆酸是名贵中药熊胆中的主要有效成分，在临床上用于治疗各种胆石疾病及急慢性肝病，具有良好的效果[2]。

目前，制备鹅去氧胆酸与熊去氧胆酸主要有动物胆汁提取和人工合成两种方法，但动物胆汁提取来源有限，难以满足医疗需要。现有合成鹅去氧胆酸与熊去氧胆酸的路线多以牛羊胆酸为起始原料，但该原料价格昂贵。作者参照文献[3-4]以廉价易得的猪去氧胆酸(hyodesoxycholic acid,HDCA)为原料合成鹅去氧胆酸与熊去氧胆酸，优化了合成工艺条件。其合成路线如图1所示。

1 实验

1.1 试剂与仪器

猪去氧胆酸(纯度≥98%)，自制，经熔点、1HNMR和MS确认；乙腈(色谱纯)；重蒸馏水；其余试剂均为国产分析纯。

YRT-3型熔点仪，天津大学精密仪器厂；Mercury Plus-400型核磁共振氢谱仪，美国Varian公司；Trace MS2000型气相色谱质谱联用仪，美国Finnigan公司；戴安P680型高效液相色谱仪；戴安UVD170U型检测器；Grace Davison Discovery Sciences C18色谱柱(4.6 mm×250 mm)。

1.2 方法

1.2.1 3α,6α-二对甲苯磺酰氧基-5β-胆烷酸甲酯(Ⅱ)的制备

取20 g猪去氧胆酸(Ⅰ)溶于120 mL甲醇中，加入12 mL浓盐酸，搅拌回流3 h，经TLC检测反应完毕；自然冷却，加入Na2CO3中和至中性，减压浓缩除去大部分甲醇，残留物用乙酸乙酯提取，滤除无机盐，滤液用饱和NaHCO3洗涤1次、水洗2次，用无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得白色固体即猪去氧胆酸甲酯20 g，粗产率为98%。

取16 g猪去氧胆酸甲酯溶于48 mL吡啶中，冰水浴搅拌溶解，然后分批加入20 g对甲苯磺酰氯(经石油醚重结晶)，冰水浴反应2 h，室温搅拌24 h，经TLC检测反应完毕;将反应液倒入加有碎冰的5%盐酸溶液中，待固体析出后，抽滤，水洗，干燥，得白色固体粉末，再用乙酸乙酯重结晶，干燥，得白色固体即化合物Ⅱ26 g，产率为93%。

1.2.2 Δ5-3β-羟基胆烷酸甲酯(Ⅲ)的制备

将28.8 g醋酸钾、160 mL DMF和24 mL水混合，升温至110 ℃后，保温15 min，加入24 g化合物Ⅱ，回流搅拌4 h，经TLC检测反应完毕；冷却至室温，有白色固体析出，倒入1 200 mL加有碎冰的5%盐酸溶液中，剧烈搅拌，过滤，水洗滤液至中性，干燥，得白色固体。向该白色固体中加入210 mL 2%的KOH甲醇溶液，室温搅拌2 h，经TLC检测反应完毕；用5%的盐酸中和至中性，减压浓缩除去大部分甲醇，加入冰水，待固体析出后，抽滤，水洗，重结晶(乙酸乙酯-石油醚)，干燥，得白色固体即化合物Ⅲ10.8 g，产率为83%。

a.37.5%HCl,MeOH b.p-TsCl,Py c.KAc,DMF,H2O d.异丙醇铝，环己酮 e.四氯苯醌，EtOAc f.m-CPBA，CH2Cl2g.10%Pd/C,EtOH h.KBH4,MeOH i.NaOH,MeOH j.NBS,Acetone-H2O k.KBH4,CeCl3·7H2O,THF-MeOH图1 鹅去氧胆酸与熊去氧胆酸的合成路线Fig.1 The synthetic routes of CDCA and UDCA

1.2.3 Δ4-3-酮胆烷酸甲酯(Ⅳ) 的制备

取10 g化合物Ⅲ溶于200 mL甲苯中，升温至110 ℃，采用分水装置蒸出约40 mL甲苯后，加50 mL环己酮，继续蒸馏出约30 mL甲苯，加入3 g异丙醇铝回流搅拌反应3 h，经TLC检测反应完毕；冷却至室温，加入10%的硫酸溶液洗涤2次，分去水层，有机相用饱和NaCl溶液洗至中性，蒸干甲苯，用乙酸乙酯提取，水洗，用无水硫酸钠干燥，浓缩，得到的固体再用无水乙醇重结晶，干燥，得到白色固体即化合物Ⅳ8.5 g，产率为85%。

1.2.4 Δ4，6-3-酮胆烷酸甲酯(Ⅴ) 的制备

取8 g化合物Ⅳ溶于250 mL乙酸乙酯中，加入8 g四氯苯醌和1 mL对甲苯磺酸，回流搅拌反应3 h，经TLC检测反应完毕；自然冷却，过滤，滤渣用乙酸乙酯洗涤，合并有机相，依次用5%NaOH溶液、饱和NaHSO3溶液、饱和NaCl溶液洗涤，用无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析(V乙酸乙酯∶V石油醚=1∶9)，得淡黄色固体即化合物Ⅴ6.5 g，产率为82%。

1.2.5 6α，7α-环氧-Δ4-3-酮胆烷酸甲酯(Ⅵ)的制备

取7.5 g间氯过氧苯甲酸加入到80 mL二氯甲烷中，冰水浴搅拌，滴加含6 g化合物Ⅴ的120 mL二氯甲烷溶液，保温反应72 h，过滤，滤渣用二氯甲烷充分洗涤，合并有机相，用饱和NaHCO3溶液洗涤，然后水洗至中性，干燥，减压浓缩，柱层析(V乙酸乙酯∶V石油醚=1∶5)，得化合物Ⅵ4.7 g，产率为75%。

1.2.6 5β，7α-羟基-3-酮胆烷酸甲酯(Ⅶ)的制备

取4 g化合物Ⅵ溶于100 mL无水乙醇中，加入3 g 10%Pd/C，在少量吡啶催化作用下搅拌吸氢反应24 h，过滤，滤渣用二氯甲烷充分洗涤，合并有机相，水洗至中性，用无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析(V乙酸乙酯∶V石油醚=1∶4)，得化合物Ⅶ3.1 g，产率为78%。

1.2.7 鹅去氧胆酸(Ⅷ)的制备

取2 g化合物Ⅶ溶于50 mL甲醇中,加入1 g KBH4,室温搅拌2 h,加入醋酸终止反应；蒸干溶剂，用乙酸乙酯提取,有机相用饱和NaHCO3溶液洗涤,然后水洗至中性,用无水硫酸钠干燥,减压浓缩，柱层析(V乙酸乙酯∶V石油醚=1∶1)，得淡黄色固体1.7 g；分别加入20 mL乙醇、0.5 g氢氧化钠和4 mL水，搅拌回流反应5 h,减压回收溶剂至干，将得到的固体加水溶解，搅拌下用5%盐酸溶液酸化，待固体析出后，抽滤，滤饼水洗至中性，干燥，用乙酸乙酯重结晶，得淡黄色固体即鹅去氧胆酸1.6 g，两步产率82%，总产率为26%，纯度经HPLC检测为97.5%。

1.2.8 5β，3α-羟基-7-酮胆烷酸(Ⅸ)的制备

取1 g鹅去氧胆酸溶于48 mL丙酮-水(3∶1，体积比)中,再加0.65 g NBS，室温下搅拌反应2 h，经TLC检测反应完毕；加入20%NaHSO3，蒸干丙酮，然后用5%的盐酸溶液酸化，待固体析出后过滤，滤渣水洗至中性，干燥，用无水乙醇重结晶后再干燥，得白色固体即化合物Ⅸ0.87 g，产率为87%。

1.2.9 熊去氧胆酸(Ⅹ)的制备

取0.8 g化合物Ⅸ和0.6 g CeCl3·7H2O溶于36 mL THF-MeOH(2∶1，体积比)中，室温搅拌下加入0.4 g KBH4并反应3 h，蒸干溶剂，得淡黄色固体；用Na2CO3溶液溶解，过滤，滤液加5%盐酸溶液酸化，待固体析出后过滤，水洗，干燥，用无水乙醇重结晶后再干燥，得白色固体即熊去氧胆酸0.68 g，产率85%，总产率为19%，纯度经HPLC检测为96.2%。

2 结果与讨论

2.1 中间产物及目标产物的结构表征

化合物Ⅱ:m.p.168～170 ℃(文献[5]值166～167 ℃)。1HNMR(400 MHz，CDCl3)，δ：7.71(d,2H,o-H×2)，7.36(d,2H,o-H×2)，7.34(d,2H,m-H×2)，7.32(d,2H,m-H×2)，4.78(t,1H,6β-H)，4.31(m,1H,3β-H)，3.68(s,3H,24-OCH3)，2.50(s,3H,p-CH3)，2.46(s,3H，p-CH3)，0.88(d,3H,21-CH3)，0.80(s,3H,19-CH3)，0.59(s,3H，18-CH3)。

化合物Ⅲ:m.p.142～144 ℃(文献[5]值143～144 ℃)。1HNMR(400 MHz，CDCl3),δ:5.35(d,1H,6-H),3.68(3H,s,24-OCH3),3.52(m,1H,3H),0.98(s,3H,19-CH3),0.91(d,3H,21-CH3),0.67(s,3H,18-CH3)。

化合物Ⅳ:m.p.122～124 ℃(文献[3]值122～124 ℃)。1HNMR(400 MHz，CDCl3),δ:5.72(s,1H,4-H),3.67(s,3H,24-OCH3),1.13(s,3H,19-CH3),0.93(d,3H,21-CH3),0.70(s,3H,18-CH3)。

化合物Ⅴ:m.p.153～154 ℃(文献[3]值151～153 ℃)。1HNMR(400 MHz，CDCl3),δ:6.13(d,1H,6-H),6.10(d,1H,7-H),5.67(s,1H,4-H),3.68(s,3H,24-OCH3),1.10(s,3H,19-CH3),0.93(d,3H,21-CH3),0.76(s,3H,18-CH3)。

化合物Ⅵ:m.p.148～150 ℃(文献[3]值149～151 ℃)。1HNMR(400 MHz，CDCl3),δ:6.10(s,1H,6-H),3.68(s,3H,24-OCH3),3.45(d,1H,7-H),3.34(d,1H,6-H),1.20(s,3H,19-CH3),0.93(d,3H,21-CH3),0.74(s,3H,18-CH3)。

化合物Ⅶ:m.p.127～128 ℃(文献[3]值128～129 ℃)。1HNMR( 400 MHz，CDCl3)，δ:3.84(s,1H,7-H)，3.68(s,3H,24-OCH3)，1.20(s,3H,19-CH3)，0.93(d,3H,21-CH3)，0.66(s,3H,18-CH3)。

化合物Ⅷ:m.p.142～143 ℃(文献[6]值144～146 ℃)。MS(m/z):392.6。1HNMR(400 MHz，DMSO-d6)，δ:11.91(s,1H,24-COOH)，4.31(d,1H,3α-OH)，4.11(d,1H,7α-OH)，3.62(m,1H,7-CH)，3.18(m,1H,3-CH)，0.97(d,3H,21-CH3)，0.87(s,3H,19-CH3)，0.62(s,3H,18-CH3)。

化合物Ⅸ:m.p.204～206 ℃(文献[7]值206～210 ℃)。1HNMR(400 MHz，DMSO-d6)，δ:11.96(s,1H,24-COOH)，4.48(d,1H,3α-OH)，2.90(q,1H,8-CH)，2.44(t,1H,6-CH)，1.10(d,3H,21-CH3)，0.92(s,3H,19-CH3)，0.65(s,3H,18-CH3)。

化合物Ⅹ:m.p.201～202 ℃(文献[8]值197～202 ℃)。MS(m/z):392.6。1HNMR( 400 MHz，DMSO-d6),δ:11.94(s,1H,24-COOH),4.44(d,1H,3α-OH),3.87(d,1H,7β-OH),0.99(d,3H,21-CH3),0.88(s,3H,19-CH3),0.61(s,3H,18-CH3)。

2.2 合成工艺的优化

1)制备化合物Δ5-3β-羟基胆烷酸甲酯(Ⅲ)时，参照文献[5]的条件，反应发现产生一极性比产品较小的杂质，经熔点和核磁共振确认该杂质为Δ5-3β-乙酰基-胆烷酸甲酯，为使其转化为化合物Ⅲ，设计了不同KOH含量的甲醇溶液与不同水解时间的正交实验，发现2%KOH 的甲醇溶液室温水解2 h时的效果最好，Δ5-3β-羟基胆烷酸甲酯(Ⅲ)的产率明显提高。

2)制备化合物Δ4-3-酮胆烷酸甲酯(Ⅳ)时，文献[3]采用柱层析，本研究尝试用无水乙醇重结晶纯化，得到了化合物Ⅳ纯品。

3)制备化合物Δ4，6-3-酮胆烷酸甲酯(Ⅴ)时，先参照文献[3]使用醋酸作催化剂，发现产物中杂质较多，然后参照文献[9]，尝试以无水AlCl3、草酸、对甲苯磺酸作为催化剂，发现对甲苯磺酸作催化剂时产物杂质少，且产率有所提高。

4)制备熊去氧胆酸(Ⅹ)过程中，对鹅去氧胆酸进行选择性还原7位酮基时文献[8]采用了剧烈的、不易控制的碱金属钠作为还原剂，不宜进行工业化生产。本研究改用温和的还原剂硼氢化钾在CeCl3催化作用下对7位酮基进行立体选择性β-还原得到熊去氧胆酸。改进后的工艺条件温和、操作简单，适宜工业化生产。

3 结论

以资源丰富的猪去氧胆酸为原料，经甲酯化后与对甲苯磺酰氯反应生成3α，6α-二对甲苯磺酰氧基-5β-胆烷酸甲酯，经消去、Oppenauer氧化、 6、 7位脱氢、环氧化、催化氢化、3位选择性还原合成鹅去氧胆酸，总产率为26%，纯度经HPLC检测为97.5%；再由鹅去氧胆酸经选择性氧化7位羟基、选择性还原7位酮基合成熊去氧胆酸，产率为74%,熊去氧胆酸总产率为19%，纯度经HPLC检测为96.2%。通过熔点、MS和1HNMR测定确证了各关键中间体及目标产物的结构。合成工艺改进后，原料猪去氧胆酸来源丰富易得，反应条件温和(不需要高温高压或低温操作)，易于实现工业化生产，具有较高的应用价值。

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