利用热带假丝酵母发酵生产长链二元酸的研究进展

桂秋芬,姚嘉旻,蒋洋松,赵意平

(淮安清江石油化工有限责任公司，江苏 淮安 223002)

长链二元酸(DCA)是指碳链上含有10个以上碳原子的脂肪族二元酸，是制造高级香料、高性能尼龙工程塑料、高档尼龙热熔胶、高温电解质、高级润滑剂、高级油漆和涂料、耐寒性增塑剂、树脂、医药和农药的重要原料[1-2]。长链二元酸不能从自然界直接获取，多采用植物油裂解法或化学合成法制取，这两种制备方法都存在很多弊端。20世纪70年代起，微生物发酵法以原料来源广、反应专一性强、反应条件温和等优势已成为绿色化学生物合成中一个重要的研究开发领域[3-5]。

长链二元酸发酵技术工业化应用始于20世纪末、本世纪初，我国和日本在此领域开展了大量工作。从1998年开始，我国在江苏、山东、辽宁等地先后建立了6家生产企业[6]。长链二元酸发酵技术工业化应用方面的研究主要集中在以下3个方面:(1)长链二元酸产酸优势菌株的选育；(2)培养基组成的优化和发酵工艺条件的调控；(3)长链二元酸后续提纯工艺的选取与优化。作者在此对这三方面的研究进展进行了综述，并提出了有待进一步研究的问题。

1 产酸优势菌株的选育

1.1 生产菌株来源

目前，国内二元酸生产企业工业化菌株主要来源于中国科学院微生物研究所、中国科学院上海植物生理生态研究所、中国石化抚顺石化研究院，这3家科研机构针对不同来源热带假丝酵母(Candidatropicalis)菌已进行了数十年之久的艰辛研究工作。

1)中国科学院微生物所 20世纪70年代起，中国科学院微生物所在方心芳院士等的带领下，开始从事微生物发酵生产长链二元酸的基础理论研究和微生物发酵正构烷烃生产长链二元酸的应用开发研究，目前发酵工业放大技术已成熟。据CN1928100A 报道利用CH-14-204菌株在50 m3发酵罐中发酵130 h，十二碳二元酸(DCA12)产酸量达145 g·L-1[7]。

2)中国科学院上海植物生理生态研究所 20世纪70年代起，该所开展微生物发酵正十五烷烃生产十五碳二元酸(DCA15)的基础理论和应用研究，发酵产酸水平接近72.5 g·L-1[8]，与中国科学院微生物所[3]水平相当。

3)中国石化抚顺石化研究院 1987年，中国石化抚顺石化研究院从中国科学院上海植物生理生态研究所购取热带假丝酵母菌株，开展微生物发酵制备DCA12、十三碳二元酸(DCA13)的应用开发研究。其中热带假丝酵母突变株SP2UV256已用于工业化发酵生产DCA13，培养6 d 的平均产酸量为156.5 g·L-1，而DCA12在10 L发酵罐中培养6 d 的平均产酸量为170 g·L-1，但工业化应用报道较少[9]。

1.2 优势菌株的选育进展

1.2.1 热带假丝酵母代谢烷烃的途径[10-12](图1)

由图1可以看出，热带假丝酵母代谢烷烃的途径可分为5个步骤：(1)酵母细胞吸收烷烃并转运至细胞内；(2)烷烃被P450酶系α-氧化成DCA12；(3)十二碳一元酸进一步被相同酶系ω-氧化成DCA12；(4)十二碳一元酸或DCA12被β-氧化成二氧化碳和水；(5)酵母细胞利用H+浓度梯度转运DCA12，分泌至酵母细胞外。其中，步骤(2)、(3)是慢速反应过程，步骤(5)是快速反应过程。

图1 热带假丝酵母烷烃代谢和糖代谢的途径Fig.1 The metabolic pathway of paraffin and sugar for Candida tropicalis

结合代谢烷烃和碳水化合物消耗的途径，高产热带假丝酵母菌株要求：(1)菌株的α，ω-氧化能力强，在蔗糖碳源中生长良好，产酸水平高；(2)菌株的β-氧化能力相对较弱，难以利用烷烃或同化烷烃生长，对产物DCA12降解能力差。

1.2.2 产酸优势菌株选育研究进展

诱变育种是基于基因突变的菌种改良方法,其理论基础是改变遗传物质DNA的结构,从而使得传代菌种在遗传性状上发生突变。20世纪90年代起，随着基因工程技术、离子束生物技术的发展，构建β-氧化阻断型菌株、低能离子束注入新兴技术手段在菌种改造方面得以应用[13]。

1)理化因素诱变

目前，应用比较成功和常用的诱变方法有：(1)紫外线照射处理诱变。紫外诱变技术早在20世纪70年代即得到应用，日本矿业公司利用紫外诱变等手段筛选出热带假丝酵母菌变异株M2030，发酵120 h可产酸130 g·L-1[14]；赵兴青[15]在筛选产DCA13菌株过程中采用蔗糖(唯一)碳源培养基、烷烃(唯一)碳源培养基、苯酚红显色培养基复合筛选假丝酵母菌株，并通过紫外诱变方法进一步提高优势菌株的产酸性能，取得了比较理想的摇瓶产酸效果；(2)亚硝酸钠处理诱变。陈远童等[16]在筛选Δ9-1,18-十八烯二元酸生产菌株过程中采用NaNO2诱变，也取得了比较好的产酸量；(3)亚硝基胍处理诱变。CN 1928100A[7]报道采用亚硝基胍作为化学诱变剂，筛选出高产假丝酵母菌CH-14-204，发酵139 h时产酸量为192.3 g·L-1；(4)多倍体诱变育种。沈永强等[17]用秋水仙碱和樟脑分别诱变菌株N-26产生多倍体细胞NPCO2和NPca18，其产生DCA15能力从出发菌株的10 g·L-1分别提高到17.3 g·L-1和18.3 g·L-1[17-18]；(5)复合诱变育种。CN95117436.3报道了一株高产长链二元酸的假丝酵母菌的筛选方法，先用硫酸二乙酯诱变假丝酵母菌，再利用紫外线二次诱变酵母细胞及氯丙嗪浓缩α,ω-氧化增强的假丝酵母菌，发酵130 h时产酸量为145 g·L-1，转化率为90%[19]。

2)利用基因工程技术改造菌种

随着分子生物学的进一步发展，基因工程技术也被用于构建长链二元酸生产菌株。美国Picataggio等用基因工程方法构建β-氧化阻断型菌株H5343,在小型发酵罐中发酵n-C12生产DCA12,产酸水平从 95 g·L-1提高到140 g·L-1[5,20]。高弘等[20]构建了肉毒碱酰基转移酶基因单拷贝缺失菌和双拷贝缺失菌，并对基因重组菌的生长及产酸特性进行研究，发现肉毒碱酰基转移酶基因双拷贝缺失菌不能够代谢烷烃。

基因工程菌易于退化，并存在某些问题，暂无工业化方法相关报道。

3)N+离子束注入诱变育种

陈祖华等[21]以热带假丝酵母SCB412作为出发菌株，经能量为50 keV、剂量为1×1011～5×1015ion·cm-2的N+离子束注入诱变处理筛选获得一株能够利用n-C12生产DCA12的高产菌株，产酸量从43.5 g·L-1上升到73.2 g·L-1；杨艳裴[22]经2次N+离子束注入对热带假丝酵母菌进行诱变，筛选到高产突变株，产酸量由29.77 g·L-1提高到73 g·L-1；CN 1928100A[7]报道通过硝基胍、亚硝酸、紫外线和N+离子束注入等多种诱变方法，筛选出高产假丝酵母菌CH-14-204，发酵139 h时产酸量为192.3 g·L-1，转化率为88.8%。

1.3 国内生产企业在菌株选育方面的进展

随着我国发酵法生产长链二元酸技术的突破，我国长链二元酸的产能已跃居世界第一。自1998年开始，借助中国科学院微生物所、中国科学院上海植物生理生态研究所、中国石化抚顺石化研究院3家科研机构的技术支持，我国在江苏、山东、辽宁等地先后建立了6家生产企业[6]。CN 02145431.0[23]报道，凯赛生物公司于2002年诱变选育出一株热带假丝酵母突变菌株(CCTCCM 202042)，利用n-C14为底物发酵可获得190 g·L-1十四碳二元酸(DCA14)；CN 1570124A[24]报道，凯赛生物公司诱变选育热带假丝酵母菌(CCTCC No.203052)，于2004年申报以C9～C18烷烃或脂肪酸为底物发酵生产正长链二元酸的方法；CN 1844404A[25]报道，南通圣诺鑫公司于2006年申报微生物发酵生产混合长链二元酸的方法；2009年山东瀚霖生物依托中国科学院微生物所发酵技术快速发展起来，并于2010年陆续申报CN 102010318A 、CN 201686632U、CN 101955424A等6项中国专利，主要涉及长链二元酸生物发酵生产装置[26-28]。

综上所述，建立合适的诱变育种方法，筛选出烷烃转化率高、发酵周期短、产酸性能强、性能稳定的优良菌株，可有效降低长链二元酸生产成本，增强该类项目的竞争力与抗风险能力。

2 发酵工艺的优化

2.1 发酵模型

长链二元酸发酵过程属非生长偶联型发酵(Gaden-Ⅲ型发酵)[29]，即酵母菌增殖与二元酸产物积累之间无关联，菌体增殖与产物代谢分两步进行(图2)：发酵前期，菌体大量繁殖，以其生长为主，pH值控制在3～5；发酵后期，菌体数量达到一定值后以菌体发酵产酸为主，pH值控制在6.5～7.5最佳[30]。

图2 长链二元酸发酵曲线Fig.2 The fermentation curves of long chain dicarboxylic acid

2.2 发酵工艺优化进展

2.2.1 培养基组分优化

长链二元酸发酵培养基需要碳源、氮源、生长必需的无机盐及微量生长因子等。刘祖同等[31]研究表明，利用热带假丝酵母生产长链二元酸，尿素是最好的氮源；但沈永强等[32]研究发现，当尿素量过高时，不积累长链二元酸。除碳源、氮源外，种子培养基中还要有生长必需的无机物及微量生长因子，如磷酸盐、氯化钠、硫酸镁、维生素、玉米浆以及酵母膏等。沈永强等[32]和许晓增等[14]还发现，磷酸二氢钠含量为0.1%～0.2%、磷酸氢二钾含量为0.4%～0.6%时利于长链二元酸积累；Mobley等[33]指出，酵母膏对增加酸产量必不可少，其最适量为0.05%～0.10%，超过此限度产酸量减少，镁离子最小量为0.05%，如果镁离子缺乏，酸产量下降约75%。

2.2.2 代谢途径及相关酶系调控

获得优良生产菌株后，对发酵过程进行必要的代谢调控十分重要。经诱变选育出来的高产菌株，其ω-氧化能力增强、β-氧化能力削弱，但β-氧化并没有完全被阻断(图1)。因此，在发酵过程中必须进一步降低β-氧化酶活力、增强ω-氧化酶活力。

1)ω-氧化酶系调控

热带假丝酵母菌在烷烃代谢过程中的α，ω-氧化过程主要由细胞色素P450酶系(CYP)、醇氧化酶(FAO)和醛脱氢酶(FALDH)等催化完成，反应在细胞内的微粒体中发生[34]。

CYP是ω-氧化过程中的关键酶和限速酶，CYP酶活力的提高必然会提高细胞的产酸能力，例如：(1)在种子培养基中(或发酵的生长阶段)加入烷烃可以诱导CYP酶活的提高。Bertrand等[35]发现CYP在以烷烃为底物时含量比以葡萄糖为底物时高出20倍。高浓度的烷烃条件下，虽然烷烃本身并不利于细胞的生长，但是却促进了CYP的表达[35-36]；(2)在烷烃代谢过程中添加Fe3+可以提高CYP酶活力[35]；(3)青霉素的添加可改善细胞膜的渗透性，有助于ω-氧化能力增强[37]；(4)苯巴比妥是CYP的诱导剂，苯巴比妥类诱导剂可与CYP基因的阻碍蛋白结合[38]。王丽菊[39]在发酵12 h时添加0.5 g·L-1苯巴比妥能增强ω-氧化能力，但过量添加则会产生抑制作用；(5)过氧化氢酶体增殖剂 (PPARs)对CYP也有诱导作用。1996年，Ohtomo等[40]报道了过氧化氢增殖因子对低等真核生物麦芽糖假丝酵母(Candidamaltosa)CYP的诱导作用；张剑等[41]指出H2O2能明显提高产酸和CYP酶活，还可以提高ω-氧化酶活力。

2)β-氧化酶系调控

热带假丝酵母降解长链二元酸的β-氧化酶系包括酰基辅酶A氧化酶(ACO)、烯酰辅酶A水合酶、3-羟基脂酰辅酶A脱氢酶、3-酮脂酰辅酶A硫解酶和乙酰辅酶A硫解酶，脂肪酸的β-氧化是降低烷烃转化率的主要因素。相关的酶还包括酰基辅酶A合成酶、肉毒碱脂酰转移酶等[42]。

在热带假丝酵母中，ACO是长链二元酸降解的限速酶，而β-氧化在过氧化物酶体中进行。脂肪酸β-氧化中间产酸[脂酰辅酶A，即HOOC-(CH2)n～SCOA]的转运是β-氧化中的重要环节，这一环节中起关键作用的是肉毒碱脂酰转移酶。研究表明，β-氧化酶系的调控方式主要有：(1)添加ACO抑制剂。丙烯酸是ACO的反竞争性抑制剂，添加量为0.05%～0.10%时有明显促进作用，但用量超过0.2%时，反而不利于二元酸的积累[38]；维生素C是ACO的竞争性抑制剂，有强烈的抑制作用[43]，但维生素C具有酸性和较强的还原性，不利于长链二元酸的分泌；(2)添加金属离子Ag+和Pb2+完全抑制ACO活性，添加Ba2+、Ca2+和Mg2+有明显抑制作用；(3)添加非离子型表面活性剂对ACO有不同程度的抑制作用[43]；(4)利用基因工程技术阻断β-氧化途径。1998年，Picataggio等用基因工程方法，构建β-氧化阻断型菌株H5343,在小型发酵罐中发酵n-C12生产DCA12,产酸水平从95 g·L-1提高到140 g·L-1[5,18]；2001年，Hara等[44]构建热带假丝酵母M1210A3，指出ACO的表达与长链二元酸产量没有必然联系，而酰基辅酶A合成酶表达量降低时，长链二元酸产量提高。

3)小分子效应物调控

近年来，人们又发现在培养基中加入产酸促进因子会提高产酸量。丙氨酸作为小分子有机酸，对微生物的TCA循环、过氧化氢酶活力和谷氨酸脱氢酶活力有影响，当其加入量为0.5%时，明显促进DCA12的产生[45]；在双底物发酵中加入醋酸钠，可以提高DCA13产量和烃酸转化率，原因可能是醋酸衍生物进入烷烃β-氧化的同化过程，提供细胞代谢所需要的碳源和能量，从而降低了产物DCA的降解，同时参与ω-氧化酶系的活性调节，促进DCA合成[46]。

2.2.3 发酵工艺调控

根据热带假丝酵母合成长链二元酸发酵体系的特点，发酵工艺中pH值、溶解氧、补料及转发酵时间对发酵影响较大。

1)pH值控制

生产长链二元酸的热带假丝酵母，其菌体生长和产酸的最适pH值不相同，菌体生长的最适pH值为5.0左右，而产酸的最适pH值在7.8±0.2[15]。pH值对细胞分泌长链二元酸以及长链二元酸的溶解性影响较大，pH值过低或过高都不利于长链二元酸的分泌，pH值过高时抑制菌体活性，中性偏碱的环境利于ω-氧化、抑制β-氧化，但在产酸发酵末期，常利用提高pH值方式促进残烃充分利用[14,47]。发酵过程中控制合理的pH值范围，既有利于难溶于水的长链二元酸转变成易溶于水的长链二元酸盐，又有利于抑制β-氧化，从而提高产酸速率和长链二元酸的纯度。

2)溶解氧控制

发酵液中溶解氧大小受通气量、罐压、搅拌速度的影响，且三种因素对溶解氧的影响大小为：搅拌速度>罐压>通气量。溶解氧不是越高越好，刘树臣等[46，48]发现在DCA13发酵中加强搅拌混合效果和控制低溶解氧是稳定提高长链二元酸产量的有效方法，在DCA12发酵中控制溶解氧水平在20%～30%最适于产酸，过高的溶解氧水平对提高产酸水平作用不明显，反而增加能耗。

3)补料控制

对于发酵法生产长链二元酸的补料控制，文献报道主要集中于双底物正构烷烃和蔗糖。其中，起始烷烃浓度、分批补加烷烃的加入量和时间与产酸的关系密切。刘祖同等[31]以DCA13为例，起始烷烃浓度为15%、每隔48 h补加10%基质的产酸量比起始烷烃浓度为8%、每隔24 h流加5%基质的产酸量提高22%。赵兴青[15]在菌体进入产酸期24 h、48 h、72 h时分别补加0.5%的蔗糖继续发酵，48 h加0.5%蔗糖时产酸量提高效果最好，但补加烷烃和蔗糖都会延长发酵时间。

4)转发酵时间控制

转发酵时间的控制决定了发酵过程的产酸水平。佟明友等[49]在DCA13发酵中在线检测参数DO、尾气中O2含量和CO2含量与菌体浓度的变化规律，发现当DO曲线降至低谷时，表明菌体的对数生长期即将结束，此时可以调节工艺条件转入产酸阶段。

3 提纯工艺研究

3.1 发酵液预处理

发酵液是一个复杂的多相体系，其中含有未反应的烷烃、酵母碎片、残留培养基、代谢产物以及微生物的分泌物等[50]。发酵终止后，将发酵液加热、破乳，经微滤膜过滤去除残留烷烃层、乳化层、菌体层，可获得澄清透亮的发酵清液即长链二元酸粗品，但存在单酸纯度偏低、总氮和铁离子含量偏高等问题，仍需进一步提纯精制。

3.2 提纯工艺进展

长链二元酸提纯工艺主要有水相提纯法、酯化提纯法、醇溶结晶法、盐析结晶法、溶剂精制法等。

1)水相提纯法

水相提纯法是用活性炭或超滤膜脱除发酵清液中部分色素、蛋白质及有机杂质等，再用浓H2SO4酸化结晶，冷却、过滤，得到长链二元酸结晶，但纯度<97.5%，色素含量仍比较高[14]。该法具有投资少、操作简单、安全环保等优点，但产品纯度低、色泽差、晶体粒度不均匀、蛋白质及其它杂质含量高。要想获得高质量产品，需进一步改进母液除杂与结晶控制的方法。

2)酯化提纯法

酯化提纯法对原料纯度要求不高，是将长链二元酸粗品与低碳醇进行酯化反应、皂化水解、酸析结晶进行精制，长链二元酸纯度可达99%以上。但该法存在醇加入量过高、反应时间长、能耗高等缺点，不适宜大规模工业化生产，还需要进一步加以研究改进[51]。

3)醇溶结晶法

醇溶结晶法是将发酵液经膜过滤除去菌体，活性炭脱色、酸化结晶、过滤，得到的湿滤饼溶解于加热的C2～C5醇类(如乙醇、辛醇、C2～C5二元醇等)中，再经活性炭脱色过滤，冷却，结晶，得到长链二元酸纯品。因常温下醇类对长链二元酸溶解性比较高，该法存在溶液损失率>15%、产品损失率约10%、产品中残留少量酯化物杂质、结晶颗粒细小等问题[52-53]。

4) 盐析结晶法

盐析结晶法是将发酵清液在碱性条件下加热，加入盐析剂，冷却，将析出的长链二元酸盐晶体再溶于热水中，经酸化结晶、分离干燥，得精制长链二元酸。该法存在酸损失较大、盐析剂投入量高、产品纯度可控性差等问题[18,53]。

5) 溶剂精制法

溶剂精制法是将发酵液经膜过滤除去菌体、活性炭脱色、酸化结晶、过滤得到的长链二元酸粗品溶解于醋酸[24]、丙酮[53]、甲基异丁基酮[54]等与其不产生化学反应的有机溶剂中，再经活性炭脱色、抽滤，滤液冷却结晶，得白色长链二元酸结晶。该法具有产品纯度高、色泽好、结晶颗粒大的优点，可满足聚合级产品质量的要求，但存在投资大、成本高、污染环境等问题。

4 结语

综上所述，现阶段长链二元酸生产菌的筛选仍主要通过传统的诱变筛选方法寻找优势菌株，其效率低、工作量大，随着新兴基因工程技术的发展，如何利用基因工程技术高效筛选性能稳定的高产菌株将是后续研究的重点。选择高效的β-氧化抑制剂和ω-氧化促进剂，以及通过发酵条件与设备的优化进一步提高生产效率是发酵工艺优化的主要方向。现有长链二元酸提纯工艺方法各有优缺点，如何组合它们的优点建立易于操作、投入少、环保、产品纯度高的提纯工艺路线，也是需要进一步研究的课题。

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