一种从富含多酚多糖的西葫芦组织中快速提取RNA的方法

周腾飞，伍 林，秦晓蓉，童 琨，童 玲，胡 适，秦 悦，易德莲，刘郭飞，李 丹

(1.武汉科技大学 应用化学研究所，湖北 武汉 430081；2.武昌理工学院生命科学学院，湖北 武汉 430223)

SOD是一种自由基清除剂，能专一地清除超氧阴离子自由基，对治疗因超氧阴离子自由基引起的各种疾病都有一定的疗效，有明显的抗辐射、防晒效果，同时还可以抑制心脑血管疾病。

西葫芦组织中含有丰富的SOD，但直接提取时产量和纯度偏低，因此要研究西葫芦产生SOD的分子机理，从西葫芦组织中提取高质量的RNA十分重要[1]。但西葫芦组织中还富含多糖多酚类物质，造成RNA的提取很困难。从植物中提取RNA的方法虽然很多，因不同组织化学组分的异质性，还没有一种适合于所有植物组织RNA的提取方法，需根据自身材料特点进行探究。作者在此对一步法[2]、尿素/氯化锂法[3]、热酚法[4]、LUG法[5]等4种方法进行对比研究，建立了一种适合西葫芦组织RNA提取的改进的CTAB方法。

1 实验

1.1 材料、试剂与溶液

西葫芦从青山区建设乡大棚基地移植，放在实验室培养，实验时即取即用。

CTAB，Tris，EDTA，NaCl，SDS，β-巯基乙醇，PVP-K30，氯仿-异戊醇(24∶1)，水饱和酚，2.0 mol·L-1醋酸钠，DEPC水，70%酒精。

所有溶液均用0.1%DEPC水配制。

CTAB提取缓冲溶液：将2%CTAB、100 mmol·L-1Tris-HCl、25 mmol·L-1EDTA、2.0 mol·L-1NaCl混合均匀后灭菌。使用前加入终浓度为2%的β-巯基乙醇和2%的PVP-K30。

SSTE缓冲溶液：1.0 mol·L-1NaCl、0.5% SDS、1.0 mmol·L-1EDTA混合均匀灭菌后使用。

1.2 仪器

玻璃器皿、研钵、碾槌在180 ℃烘烤过夜；枪头用DEPC水浸泡4 h，然后灭菌，烘箱烘干；电泳槽先用3%的双氧水浸泡1 h，然后再用DEPC水浸泡过夜。

1.3 总RNA的提取

1.3.1 提取方法的比较

对比研究一步法、尿素/氯化锂法、热酚法、LUG法提取西葫芦叶的RNA的质量和产量，建立了新的RNA提取方法即改进的CTAB法。

1.3.2 改进的CTAB法提取RNA步骤

在预冷的研钵中加入2 g样品、0.3 g PVP-K30，研磨，每个研钵中加30 μLβ-巯基乙醇、15 mL CTAB提取缓冲溶液，转移至离心管，混合均匀；在65 ℃水浴中加热5 min，其间轻轻摇动，向混合物中加入3 mL pH值为4.0的2.0 mol·L-1醋酸钠溶液和15 mL水饱和酚轻轻混匀，再加3 mL氯仿-异戊醇，于13 ℃、15 000 g离心10 min；向上清液中加入等体积的氯仿-异戊醇，于13 ℃、15 000 g离心10 min；再向上清液中加入等体积冷处理过的异丙醇，混匀，置于冰上沉淀20 min，于4 ℃、25 000 g离心10 min；向沉淀中加入1 mL 70%的乙醇(注意不要搅动)，于4 ℃、25 000 g离心10 min；再向沉淀中加入1 mL无水乙醇，于4 ℃、25 000 g离心10 min，加入 500 μL SSTE缓冲溶液溶解沉淀，加氯仿-异戊醇(体积比1∶1)抽提1次；上清液转移到1.5 mL离心管中，加入等体积冷处理过的异丙醇，然后置于冰上20 min，于4 ℃、20 000 g离心15 min；沉淀先后用400 μL 70%乙醇、400 μL无水乙醇洗涤，倒掉乙醇，加50 μL DEPC水溶解。

1.4 总RNA分析

RNA的质量和数量用230 nm、260 nm和280 nm处的紫外吸收值来评定：A260/230值用来判定提取的RNA中是否有多酚和多糖的污染，A260/280值用来判定提取的RNA中是否有蛋白质的污染。提取的总RNA样品在1.2%的琼脂糖凝胶上电泳，Goldview染色，在紫外灯下观察RNA的完整度。

1.5 RT-PCR

cDNA用 RevertAidTMFirst Strand cDNA synthesis Kit (M-MuLV，Fermentas，Canada)来合成，PCR采用Cu/Zn-SOD基因的简并引物，反应条件为：94 ℃处理3 min，然后6个循环，变性温度94 ℃处理30 s，延伸温度72 ℃处理45 s，退火温度从63 ℃ 30 s开始，每个循环降低1 ℃；紧接着35个循环，变性温度94 ℃处理30 s，退火温度58 ℃处理30 s，延伸温度72 ℃处理45 s；最后终极延伸72 ℃处理10 min。

2 结果与讨论

2.1 西葫芦RNA的提取结果

用5种方法提取西葫芦叶中RNA的电泳结果见图1，每个泳道RNA上样量为3.5 μg。

1.一步法 2.尿素/氯化锂法 3.热酚法4.改进的CTAB法 5.LUG法图1 5种方法提取西葫芦叶中RNA的电泳结果Fig.1 RNA Electrophoretogram of Cucurbita pepo leaf extracted with five different methods

由图1可知，用一步法、尿素/氯化锂法、热酚法、LUG法等4种方法不能提取高质量的RNA；用改进的CTAB法，RNA样品在琼脂糖凝胶上展示了完整的28S和18S两条RNA链，并且28S rRNA的亮度大约是18S rRNA的2倍，说明提取的RNA没有或者很少降解。A260/230值为2.08、A260/280值为2.0，说明提取的RNA中没有多酚、多糖、蛋白质的污染，是高质量的RNA，RNA产量为210 μg·g-1鲜质量。RT-PCR的结果经过测序之后，在GenBank数据库中经过NCBI-BLAST比对，与印度南瓜的同源性达89%。用改进的CTAB法从西葫芦果肉中也获取了高质量的RNA，表明改进的CTAB法可以有效提取西葫芦组织中的RNA。

2.2 讨论

植物RNA提取中最主要的问题就是RNA的降解和污染。西葫芦组织中富含多糖、多酚以及次级代谢产物，严重妨碍RNA的提取，尤其是多糖和RNA有相似的生物化学特性，会与RNA形成凝胶状的材料进而与RNA共沉淀，干扰RNA的产量和质量[6-7]。因此，有效地移除污染物并使RNase失活可以保证RNA的质量。

一步法、尿素/氯化锂法、热酚法、LUG法等4种方法均不能提取高质量的未降解的RNA，研究并建立了一种新的RNA提取方法即改进的CTAB法：以CTAB和SDS裂解细胞壁；以异丙醇代替氯化锂沉淀RNA；以高浓度的NaCl(1.0～2.5 mol·L-1)和醋酸钠移除多糖[8]；依据PVP-K30可以和多酚类物质通过氢键形成复合物的特性，从匀浆液中移除多酚类物质[9]；以β-巯基乙醇作为还原剂抑制多酚化合物的氧化成醌，避免和RNA共沉淀[10-11]，同时破坏二硫键来使RNase失活[9]。

改进的CTAB法在一开始就抑制了RNase的活性，并且在RNA提取全过程中都有RNase抑制剂的存在；提取过程全程低温，从而降低RNase的活性，并且酚类化合物不和核酸反应，在第一步离心时就和其它碎片一起沉淀[12]；在CTAB提取缓冲溶液中加入2.0 mol·L-1NaCl、在SSTE缓冲溶液中加入1.0 mol·L-1NaCl来移除多糖类物质；以异丙醇代替氯化锂沉淀RNA，沉淀时间大幅缩短，提取全程只需2 h，大大降低了RNA降解的可能性。用该方法从西葫芦叶和果肉中都提取出了高质量的RNA。

3 结论

(1)对比研究了一步法、尿素/氯化锂法、热酚法、LUG法等4种方法，建立了一种适合西葫芦组织RNA提取的改进的CTAB方法。用该方法从西葫芦叶中提取的RNA在琼脂糖凝胶电泳上很清楚显示出28S和18S两条链，A260/280值为2.08、A260/230值为2.0，表明提取的RNA没有多酚、多糖、蛋白质污染；RNA产量为210 μg·g-1鲜质量；对RT-PCR的结果进行测序，通过NCBI-BLAST比对可知，与印度南瓜的同源性达89%。用该方法从西葫芦果肉中也获取了高质量的RNA。改进的CTAB法全程只需2 h，不用液氮、亚精胺、二硫苏糖醇、蛋白酶K等试剂，不仅有效、经济，而且从西葫芦组织中提取出来的RNA的质量和产量均很高。

(2)用改进的CTAB法从西葫芦茎和南瓜的根、茎、叶、果实中也提取出了高质量的RNA。

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