侵袭性念珠菌感染的实验室研究进展

苏建荣，丁秀荣

侵袭性念珠菌感染的实验室研究进展

苏建荣，丁秀荣

近年来，侵袭性念珠菌感染的流行趋势发生了改变，致病菌种也有明显变迁。除光滑念珠菌和克柔念珠菌外，大部分念珠菌对常用抗真菌药物仍然敏感。随着分子生物技术的应用，真菌感染早期的、特异诊断水平有了明显提高，对真菌耐药机制的认识也更加深入。本文就侵袭性念珠菌感染的实验室研究进展进行综述。

念珠菌病；流行学；实验室；诊断；抗药性；真菌

侵袭性真菌感染（invasive fungal infections,IFI）是指真菌侵入内脏、血液、黏膜或表皮角质层以下深部皮肤结构引起的感染。80%的IFI由念珠菌引起，其中由白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌和克柔念珠菌引起的感染占念珠菌血症的97%，其余的则由12～14种较稀有的念珠菌引起[1]。在过去的20年中，念珠菌血症的发生率增加了10倍，致病菌种也有明显变迁[2]。提高真菌感染的早期、特异诊断水平，充分认识其耐药机制，成为临床检验工作中急须解决的问题。

1 侵袭性念珠菌感染（invasive Candida infection,IFI）的流行趋势

1.1 发病率和危险因素近30年来，随着免疫功能低下患者的不断增加，IFI呈持续增多趋势。根据我国医院感染监控网显示，真菌感染率由1999年的0.16%（519/324337）到2000年的0.23%（2522/ 1096461）再到2002年的0.24%（4323/1799868），呈不断上升趋势[3]。在美国，念珠菌血症在医院血流感染中位居第4，而且，与1992—1993年相比，2008—2011年由近平滑念珠菌和光滑念珠菌引起的IFI的比例分别增加了2倍和4倍[4]。欧洲的情况同样不容乐观，2006年，英国健康保护局公布，在英国每年大约有5000例IFI[5]。

IFI患者中，65岁以上的老年患者占83.1%[6]，无疑，人口老龄化是当今IFI高发的一个重要社会因素。医疗技术的进步，也为IFI的发生提供了可乘之机。据文献统计，90%的念珠菌血症患者在近期使用过抗生素；80%以上有中心静脉导管和肠外营养治疗史，50%以上有外科手术史（30 d内），10%以上有肿瘤化疗史[7-9]。入住重症监护病房（intensive care unit,ICU）也是IFI的危险因素。Yang等[10]发现，39.7%的IFI病例发生在ICU。预防性使用氟康唑，则是公认的非白色念珠菌（光滑念珠菌和克柔念珠菌）感染的危险因素[5，7]。此外，器官移植、肾替代治疗、机械性通气等也与IFI相关，但其相关性不同文献报道差异较大。

1.2 菌株分布引起IFI的念珠菌多达30多种。其中，白色念珠菌的感染率一直居首位。尤其在北欧和瑞士，由白色念珠菌引起的感染占IFI的60%以上。近年来，非白色念珠菌的感染率不断升高，在某些地区甚至超过白色念珠菌的感染率，而且其菌种分布有明显的地域性。例如，光滑念珠菌在美国感染率为18.8%～24.0%，在英国为22.7%，而在巴西仅为4.9%。近平滑念珠菌比较容易从科威特（30.6%）和西班牙（23.0%）分离到，而在北欧其感染率仅为4.4%。热带念珠菌在南美的感染率最高（20.9%～24.2%)，在北欧最低（4.0%）[11]。菌种分布差异在我国国内也存在。近期一项多中心的研究显示，由非白色念珠菌引起的血流感染中，近平滑念珠菌最常见[12]。但在南京市[13]、重庆市[14]等南方地区，热带念珠菌的感染率居非白色念珠菌的首位。基于这种菌种分布的差异，及时调查当地的真菌流行情况，比参照全球或全国性的报道对临床更有指导价值。

1.3 耐药性近年来，关于念珠菌耐药的报道层出不穷。事实真的如此吗?拉丁美洲一项多中心的研究显示，99%以上的白色念珠菌、近平滑念珠菌和热带念珠菌对氟康唑敏感，光滑念珠菌中92.9%为剂量依赖敏感，7.1%对氟康唑耐药[8]。在意大利和西班牙，98.6%的白色念珠菌、97.3%的近平滑念珠菌、95.5%的热带念珠菌和54.4%的光滑念珠菌对氟康唑敏感[15]。在中国，对氟康唑敏感的白色念珠菌、近平滑念珠菌和热带念珠菌占到94%以上，光滑念珠菌中87.8%为剂量依赖敏感，12.2%对氟康唑耐药[12]。可见，白色念珠菌、热带念珠菌和近平滑念珠菌对唑类药物的敏感率仍很高；而光滑念珠菌的耐药率不同报道间存在较大差异。这可能与当地氟康唑的预防性使用情况相关，与其他念珠菌相比，光滑念珠菌在氟康唑的选择压力下更容易发展为耐药菌[16]。

近年来，棘白菌素类药物在临床上的使用开始增多，除了近平滑念珠菌和季也蒙念珠菌外，99%以上的临床常见念珠菌可被＜2μg/ml的棘白菌素类药物所抑制，即使对氟康唑耐药的念珠菌及其生物膜也有较好的杀菌效果[16]。调查显示，2001—2004年，血流来源的耐氟康唑的光滑念珠菌对棘白菌素的耐药率为0.9%（1/110），2006—2010年耐药率增长到11.1%（18/162），而且这些耐药株均来自美国[17]。一项全球性调查显示，血流来源的耐氟康唑的光滑念珠菌对棘白菌素的耐药率北美洲为3%，欧洲为1%，拉丁美洲为0%，亚太地区为0%[18]。可见，随着棘白菌素临床应用的增加，念珠菌对其耐药率也随之发生着变化。

2 IFI的分子实验室诊断技术

IFI早期症状隐匿，病死率高。如何提高真菌感染的早期、特异诊断水平是目前临床真菌学领域的研究热点，也是临床检验中要解决的关键问题。近年来分子生物技术的发展和应用，为真菌感染的早期诊断提供了新的思路。

2.1 聚合酶链反应（PCR）PCR方法是目前分子诊断中最常用的方法，可将菌种鉴定时间由传统方法的24～48 h缩短到6～8 h。一项大型荟萃分析显示，在确诊或疑似IFI患者中，PCR方法检测的阳性率为85%（78%～91%），而血培养方法的阳性率为38%（29%～46%）；采用实时PCR检测念珠菌血症的灵敏度和特异度分别为87%和100%，而平行的2种血清学方法的灵敏度和特异度分别为47.5%和82.6%以及96%和81%，均不及PCR方法[19]。

污染是临床应用PCR方法的主要障碍，其阳性结果无法区分是感染、污染还是定植。缺乏标准化也是PCR方法的一个重要缺陷，限制了其在临床实践中的广泛应用。

2.2 基因芯片技术基因芯片技术是一种以高通量为特点的检测技术。商品化的基因芯片，如芬兰的Prove-itTMSepsis assay，可同时鉴定34种细菌和8种真菌，而且，它既可以检测分离株又可以直接检测阳性血培养物，灵敏度和特异度分别为94.0%和98.0%[20]。Aittakorpi等[1]将该芯片的念珠菌检测范围扩展到了13种，经验证其灵敏度和特异度分别为99%和97%。Leaw等[21]设计的芯片可检测77种真菌，其中包括44种念珠菌，该芯片的灵敏度为100%，特异度为97%。利用芯片技术不仅将菌种鉴定时间缩短到3～4h，还可以同时鉴定混合感染中的多种病原菌，无须分离培养，从而进一步缩短了鉴定时间。

但是，基因芯片技术对DNA的量和纯度要求较高，费用也高，所以尚未在临床真菌检验中广泛使用。但是，基因芯片技术快速、高通量和灵敏的优势，无疑使其具有极大的应用前景。

2.3 焦磷酸测序技术焦磷酸测序技术是新一代DNA测序技术。该方法的重复性和精确性可与传统的Sanger法相媲美，但不需要电泳，不需要对样品标记和染色，检测速度大大提高。焦磷酸测序技术对念珠菌属中的大多数致病菌可准确鉴定，且可区分表型非常相近的念珠菌。Borman等[22]运用焦磷酸测序技术，从1839株白色念珠菌标本中鉴定出15株C.africana，并明确区分出近平滑念珠菌复合体中的C.parapsilosis、C.metapsilosis和C.orthopsilosis菌种。

目前，焦磷酸测序仅能测定100 bp以内的核酸片段，对重复序列测定准确性较差，鉴定亲缘关系较近的菌株可能须借助不止一对引物。

2.4 质谱技术近年来，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption ionization time of flightmass spectrometry,MALDI-TOF-MS）技术在微生物鉴定中的应用受到广泛关注。商品化的微生物鉴定质谱仪主要有布鲁克公司的MALDI BiotyperTM和梅里埃公司的VITEK MSTM，质谱数据库中有近4000种常见微生物的特征指纹图谱，用户还可以根据需要随时添加。

MALDI-TOFMS对念珠菌分离株的鉴定准确率为96%～100%，也可以直接鉴定阳性血培物中病原真菌，并且可区分表型和基因型非常相近的菌种[23-24]。Spanu等[25]用MALDI-TOFMS技术对340份阳性血培养标本进行检测，对白色念珠菌和非白色念珠菌的检测灵敏度分别为95.9%和86.5%，菌种鉴定时间缩短到30min，但该方法对同时存在多种病原体的标本无法鉴定。

MALDI-TOFMS对微生物的鉴定是通过所获得的质谱图与已知数据库进行匹配分析来实现的，所以对待测标本质谱信息有影响的因素，以及相关数据库的构成和质量对其鉴定的准确性有影响[26]。

3 念珠菌对常用抗真菌药物的耐药机制

借助分子生物技术，人们对真菌的耐药机制有了深入的了解，特别在念珠菌对唑类药物和棘白菌素的耐药机制研究中取得了长足的进步。

3.1 对唑类药物的耐药机制唑类药物的作用靶位酶为14-α-去甲基酶（14-DM），它是真菌细胞膜麦角甾醇合成的关键酶。14-DM由ERG11基因编码。据文献报道，白色念珠菌的唑类耐药株均存在ERG11的多点突变，和（或）ERG11的过度表达；而编码麦角甾醇合成途径中其他酶的基因（如ERG3、ERG5、ERG24、ERG6等）的突变或过度表达也可降低白色念珠菌对唑类药物的敏感性[27]。

多耐药转运蛋白也与白色念珠菌对唑类药物耐药密切相关。目前已知的多耐药转运蛋白是ABC转运蛋白和主要易化载体超家族（MFS）。其中，编码ABC转运蛋白的CDR基因中仅CDR1和CDR2与唑类药物耐药相关，而且，CaCDR1的高表达比CaCDR2更关键[28]。编码MFS的MDR基因仅与念珠菌对氟康唑的耐药相关，与其他唑类药物的交叉耐药无关；而编码MFS的另一基因FLU1，是否与唑类药物耐药相关，尚待确定[29]。

在光滑念珠菌对唑类药物的耐药机制中起主导作用的是编码ABC转运蛋白的CgCDR1和CgCDR2基因，其中CgCDR2的过度表达起主要作用。尚无证据表明光滑念珠菌ERG11基因突变或表达水平改变参与其对唑类药物耐药。

与光滑念珠菌相反，热带念珠菌耐药株不仅ERG11基因的表达明显上调，而且存在多点突变（主要是Y132F和S154F）。但编码多耐药转运蛋白CDR1和MDR1的基因表达量无明显改变[30]。

3.2 对棘白菌素的耐药机制棘白菌素的靶位酶是位于真菌细胞壁的1,3-β-D葡聚糖合成酶，其编码基因是FKS（FKS1和FKS2）。对棘白菌素耐药的白色念珠菌的基因突变主要发生在FKS1的2个热点区：氨基酸残基641～649和残基1345～1365。光滑念珠菌的基因突变则发生在FKS1或FKS2。据报道，美国发现的18株耐棘白菌素的光滑念珠菌中，9株为FKS1突变，7株为FKS2突变。而近平滑念珠菌对棘白菌素天然不敏感，因为该菌种FKS1的第660个氨基酸残基——脯氨酸被丙氨酸所代替[16]。

目前研究较多的还有热休克蛋白90（Hsp90）调节的念珠菌属对棘白菌素的耐药。Hsp90通过其客户蛋白参与念珠菌多条信号转导通路的调节，对真菌由于快速选择而产生的耐药性及这种耐药性的维持起重要作用[31]。Hsp90最关键的客户蛋白是钙调磷酸酶，Hsp90就是通过稳定钙调磷酸酶的催化亚基，实现对白色念珠菌的棘白菌素耐受性的调节，该过程中钙调磷酸酶的下游效应因子Crz1也发挥了重要作用。适量的Hsp90抑制剂（格尔德霉素或赤根壳菌素），可减弱白色念珠菌对棘白菌素的耐受性，并与棘白菌素产生协同抗菌作用，这充分肯定了Hsp90在调节念珠菌属对棘白菌素耐药中的作用。

在研究念珠菌对棘白菌素的耐药机制时，一个值得注意的现象就是矛盾生长现象。该现象是指在微量肉汤稀释法药物敏感性（药敏）实验中，某些种类的念珠菌在较低浓度的棘白菌素中被杀死，而在较高浓度的棘白菌素中持续存在时反而生长的现象。随着对该现象研究的不断深入，多数研究者认为，该现象可能只是念珠菌的一种自我补偿机制而非耐药机制。而且，Shields等[32]发现该现象的发生可被健康人血清所抑制，认为该现象不会在体内发生。

3.3 药敏影响因素须注意的是，血清、温度和pH值等因素，会对不同抗真菌药物的敏感性产生不同的影响。

3.3.1 血清人类血清对多种抗真菌药物的药效学有影响。如在血清存在情况下，氟康唑对白色念珠菌的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration,MIC）平均降低2个稀释度（4倍）；而伊曲康唑和酮康唑的MIC却明显升高；两性霉素B的MIC虽然不变，但其杀菌活性和后续杀菌效应降低；米卡芬净和阿尼芬净对不同念珠菌的MIC也明显升高；但卡泊芬净受影响较小[16]。以上表明，血清对蛋白结合率高的药物或许有降低药效的影响，这须要提请临床医师注意。

3.3.2 温度念珠菌血症患者常伴发高热。研究者将体外药敏实验的培养温度提高到39℃，发现在此温度下米卡芬净显示出比37℃时更好的杀菌效果[33]。如果这方面的实验结果得到广泛证实，那么对我们更好利用抗真菌药物会有所帮助。

3.3.3 pH值霉菌性阴道炎是妇科常见病，那么阴道特殊的pH值条件是否会影响抗真菌药物的疗效呢？研究表明，在pH值≤4时，念珠菌对唑类药物和两性霉素B的敏感性降低，但对棘白菌素的敏感性不受影响[34]。

4 结语

IFI的发病率逐年上升，对其早期、快速、准确诊断，对高危患者的救治有重要意义。真菌分子生物检测方法具有方便、快速等优势，有较好的应用前景。深入研究真菌对常用抗真菌药物的耐药机制则有利于临床合理使用抗真菌药物，控制真菌耐药性的发生。对临床疑似IFI的患者，应联合应用多种检测技术进行诊断，并合理使用抗真菌药物，防止耐药菌的产生和传播。

[1]Aittakorpi A,Kuusela P,Koukila-KähköläP,et al.Accurate and rapid identification of Candida spp.frequently associated with fungemia by using PCR and themicroarray-based prove-it sepsis assay［J］.JClin Microbiol,2012,50(11):3635-3640.

[2]李若瑜.应用现代化诊断方法提高我国真菌病诊断水平［J］.中华检验医学杂志，2008，31(2):125-127.

[3]任南，文细毛，徐秀华，等.全国医院感染监控网院内真菌感染监测及临床意义［J］.中华流行病学杂志，2004，25(6):549.

[4]Cleveland AA,Farley MM,Harrison LH,et al.Changes in incidence and antifungal drug resistance in candidemia:results from population-based laboratory surveillance in Atlanta and Baltimore, 2008-2011［J］.Clin Infect Dis,2012,55(10):1352-1361.

[5]Muskett H,Shahin J,Eyres G,etal.Risk factors for invasive fungal disease in critically ill adult patients:a systematic review［J］. Crit Care,2011,15(6):R287.

[6]邢志广，廖卫，张守亮.329株深部真菌感染菌种分布及药敏试验分析［J］.中国真菌学杂志，2009，4(1):33-34.

[7]Leroy O,Mira JP,Montravers P,et al.Comparison of albicans vs. non-albicanscandidemiain French intensivecareunits［J］.Crit Care, 2010,14(3):R98.

[8]NucciM,Queiroz-Telles F,Alvarado-Matute T,etal.Epidemiology of candidemia in Latin America:a laboratory-based survey［J］. PLoSOne,2013,8(3):e59373.

[9]赵鸿，王慧芬，王福川，等.肝衰竭患者并发念珠菌感染的临床特征分析［J］.传染病信息，2012，25(4):226-228.

[10]Yang ZT,Wu L,Liu XY,etal.Epidemiology,species distribution and outcome of nosocomial Candida spp.bloodstream infection in Shanghai［J］.BMC Infect Dis,2014,14:241.

[11]Falagas ME,Roussos N,Vardakas KZ.Relative frequency of albicans and the various non-albicans Candida spp among candidemia isolates from inpatients in various parts of the world:a systematic review［J］.Int J Infect Dis,2010,14(11):e954-e966.

[12]Wang H,Xiao M,Chen SC,etal.In vitro susceptibilities of yeast species to fluconazole and voriconazole as determined by the 2010 National China Hospital Invasive Fungal Surveillance Net(CHIFNET)study［J］.JClin Microbiol,2012,50(12):3952-3959.

[13]Ma CF,Li FQ,Shi LN,etal.Surveillance study of species distribution,antifungal susceptibility and mortality of nosocomial candidemia in a tertiary care hospital in China［J］.BMC Infect Dis, 2013,13:337.

[14]Zhang XB,Yu SJ,Yu JX,etal.Retrospective analysis of epidemiology and prognostic factors for candidemia at a hospital in China, 2000-2009［J］.Jpn JInfect Dis,2012,65(6):510-515.

[15]Bassetti M,Merelli M,Righi E,et al.Epidemiology,species distribution,antifungalsusceptibility,and outcomeofcandidemiaacross fivesites in Italyand Spain［J］.JClin Microbiol,2013,51(12):4167-4172.

[16]苏建荣，丁秀荣.棘白菌素类药物对念珠茵的耐药机制及抗真菌活性检测的研究进展［J］.中华检验医学杂志，2013，36(7):588-591.

[17]Pfaller MA,Castanheira M,Lockhart SR,et al.Frequency of decreased susceptibility and resistance to echinocandins among fluconazole-resistantbloodstream isolateso fCandidaglabrata［J］.JClin Microbiol,2012,50(4):1199-1203.

[18]Pfaller MA,Moet GJ,Messer SA,etal.Candida bloodstream infections:comparison of species distributions and antifungal resistance patterns in community-onset and nosocomial isolates in the SENTRY Antimicrobial Surveillance Program,2008-2009［J］.Antimicrob Agents Chemother,2011,55(2):561-566.

[19]Cortés JA,Concha MA,Cediel T LE,etal.Diagnostic methods in candidemia:a systematic review of literature with meta-analysis［J］.Rev Chilena Infectol,2011,28(5):423-428.

[20]吴真，徐晓刚.深部真菌病的实验诊断进展［J］.中国感染与化疗杂志，2014，14(1):82-85.

[21]Leaw SN,Chang HC,Barton R,et al.Identification of medically important Candida and non-Candida yeast species by an oligonucleotide array［J］.JClin Microbiol,2007,45(7):2220-2229.

[22]Borman AM,Szekely A,Linton CJ,etal.Epidemiology,antifungal susceptibility,and pathogenicity of Candida africana isolates from the United Kingdom［J］.JClin Microbiol,2013,51(3):967-972.

[23]Westblade LF,Jennemann R,Branda JA,et al.Multicenter study evaluating the Vitek MS system for identification ofmedically important yeasts［J］.JClin Microbiol,2013,51(7):2267-2272.

[24]Yaman G,Akyar I,Can S.Evaluation of the MALDI TOF-MS method for identification of Candida strains isolated from blood cultures［J］.Diagn Microbiol Infect Dis,2012,73(1):65-67.

[25]Spanu T,Posteraro B,Fiori B,etal.DirectMALDI-TOFmass spectrometryassayofblood culturebroths for rapid identification of Candida species causing bloodstream infections:an observational study in two large microbiology laboratories［J］.JClin Microbiol, 2012,50(1):176-179.

[26]鲍春梅，宋新爱，崔恩博，等.MALDI-TOF-MS鉴定宋内志贺菌的临床应用［J］.传染病信息，2014，27(3):152-156.

[27]郭朝霞，李海涛，杨蓉娅.常见致病真菌唑类耐药基因研究进展［J］.国际皮肤性病学杂志，2013，39(3):197-200.

[28]Sanglard D,Coste A,Ferrari S.Antifungal drug resistancemechanisms in fungal pathogens from the perspective of transcriptional gene regulation［J］.FEMSYeast Res,2009,9(7):1029-1050.

[29]Pfaller MA.Antifungal drug resistance:mechanisms,epidemiology, and consequences for treatment［J］.Am JMed,2012,125(1 Suppl):S3-S13.

[30]Jiang C,Dong D,Yu B,etal.Mechanisms of azole resistance in 52 clinical isolatesof Candida tropicalis in China［J］.JAntimicrob Chemother,2013,68(4):778-785.

[31]Pearl LH,Prodromou C.Structure and mechanism of the Hsp90 molecular chaperonemachinery［J］.Annu Rev Biochem,2006,75: 271-294.

[32]Shields RK,Nguyen MH,Du C,etal.Paradoxical effect of caspofungin against Candida bloodstream isolates ismediated bymultiple pathwaysbut eliminated in human serum［J］.Antimicrob Agents Chemother,2011,55(6):2641-2647.

[33]Cho T,Nagao J,Imayoshi R,et al.In vitro efficacy of continuous mild heatstresson the antifungal susceptibility of Candida albicans biofilm formation［J］.Biol Pharm Bull,2012,35(8):1371-1373.

[34]Danby CS,Boikov D,Rautemaa-Richardson R,etal.Effect of pH on in vitro susceptibility of Candida glabrata and Candida albicans to 11 antifungalagentsand implications for clinicaluse［J］.Antimicrob Agents Chemother,2012,56(3):1403-1406.

（2014-07-19收稿2014-08-22修回）

（责任编委曲芬本文编辑王姝）

Laboratory study on invasive Candida infections:an update

SU Jian-rong,DING Xiu-rong
Clinical Laboratory Center,Beijing Friendship Hospital,Capital Medical University,Beijing 100050,China

The epidemiology of invasive Candida infections has changed markedly in recent years.Obvious changes also have taken place in the distribution of pathogenic fungi.Most of Candida isolates are susceptible to common antifungal agents,except C. glabrata and C.krusei.With more and more widespread and profound application ofmolecular biological techniques in researches of fungi,the level of early and specific diagnosis of fungal infections has improved significantly and the understanding of resistance mechanism of fungi is alsomuch deeper.This article focuses on laboratory study on invasive Candida infections.

candidiasis;epidemiology;laboratory;diagnosis;drug resistance;fungal

R519.3

A

1007-8134(2014)05-0311-04

100050，首都医科大学附属北京友谊医院临床检验中心（苏建荣、丁秀荣）