脉冲场凝胶电泳在感染性疾病诊治中的应用

李玉芝，陈志海

·专题综述·

脉冲场凝胶电泳在感染性疾病诊治中的应用

李玉芝，陈志海

脉冲场凝胶电泳（pulsed-field gelelectrophoresis,PFGE）被视为感染性疾病暴发疫情中流行病学关系分析的“金标准”，目前主要用于细菌性感染性疾病的流行病学研究及细菌分子分型。在医院临床工作中，PFGE在相关感染性疾病的临床诊治、院内感染的溯源与控制等方面同样有很好的应用前景。本文就PFGE在医院临床工作中的应用进行综述。

电泳，凝胶，脉冲场；传染病；交叉感染

脉冲场凝胶电泳（pulsed-field gelelectrophoresis,PFGE）是分离大分子线性DNA的电泳技术。PFGE采用了2个交变电场，即2个方向不同的电场交替开启和关闭，使DNA分子的电泳方向随着电场的变化而改变。每当电场方向发生改变时，大于20 kb的DNA分子就要沿新的电场轴重新定向，适应凝胶中不规则孔隙变化，而后才能继续前行。DNA分子越大，这种重新定向所需时间也越长，真正用于前行的时间越短。根据被分离的DNA分子范围选择适当的脉冲时间，如果电泳脉冲周期大于DNA分子的重新定向时间，DNA分子就可以按大小被分离开来。普通琼脂糖凝胶电泳分离DNA分子的上限是50 kb，而PFGE能分辨高达10mb的DNA分子。

PFGE主要用于感染性疾病的流行病学研究及细菌分子分型，疾病预防控制中心（Center for Disease Controland Prevention,CDC）则利用PFGE验证传染病的暴发流行，追溯传染源及传播途径[1]。在医院临床工作中，PFGE在相关感染性疾病的临床诊治、院内感染的溯源与控制等方面同样有很好的应用前景，但目前临床医师对该技术在临床方面的应用了解较少。本文就PFGE在医院临床工作中的应用进行综述。

1 PFGE在暴发性感染性疾病和群体性食物中毒临床诊治中的应用

作为最早接触患者的一线临床医师，及早识别并证实感染性疾病及群体性食物中毒的暴发流行，对感染性疾病的预防控制有重要意义。同时，PFGE谱型相同的菌株具有相同或相近的致病性和耐药性[2-3]，笔者对导致腹腔感染的大肠埃希菌的PFGE谱型分析和耐药性研究中也发现PFGE谱型相似性大于85%的菌株间耐药谱相同或相似。在临床诊治上可以相互借鉴，通过总结先发病例的诊治经验或教训，预估后续病例的病程及发展规律，优化治疗方案，提高救治成功率。

2011年5月德国O104：H4疫情中，PFGE的价值得到了完美验证。德国汉堡市某医院一天内接诊了3例儿童溶血尿毒综合征（heomlytic uremic syndrome, HUS）患者[4]。此后2个月内德国多个地区出现了数千例类似患者，主要症状有血便、腹痛、呕吐等，其中很多患者发生HUS。粪便培养结果为产志贺毒素的出血性大肠埃希菌O104：H4阳性。Frank等[5]对来自各地的120株分离菌株进行PFGE分析，发现均具有相同的PFGE谱型，从分子水平证实为同一来源的O104：H4暴发流行。同时，分离菌株表达相同的毒力因子，具有相同的耐药特征，感染者HUS发病率高，为临床治疗提供了较强的理论支持。早期感染者应用快速杀菌性抗生素可促进细菌毒素释放，导致HUS发病率增高，因此后续病例不再推荐使用此类抗生素。此次暴发中部分HUS患者透析治疗无效。Lapeyrague等[6]报道了3例HUS重症患儿，同时给予透析和eculizumab单克隆抗体，均获得成功。随后的193例重症HUS患者使用了透析联合eculizumab单克隆抗体治疗[7]，表明相同PFGE谱型的细菌感染在临床诊治上相互借鉴，以制订更完善的诊疗方案，可提高后续病例的救治成功率。

同期，美国也出现了6例类似患者[8]。其临床标本中都分离出了与德国PFGE谱型相同的O104：H4菌株，并具有相同的毒力基因和药物敏感性（药敏）特点，提示美国与德国病例的菌株来源相同，临床医师可据此制订相同的诊疗方案。

此外，借助PFGE技术，Longenberger等[9]发现了一起因牛奶消毒不合格导致的耶尔森菌感染在美国宾夕法尼亚州的流行，美国CDC也曾证实空肠弯曲菌[10]、切斯特沙门菌[11]、海德堡沙门菌[12]及李斯特菌[13]感染的跨州界流行，加拿大Gaulin等[14]亦发现了李斯特菌感染在魁北克省的流行。

王艺等[15]对深圳市2007—2008年分离出的副溶血弧菌进行PFGE分型分析，发现该地区既存在副溶血弧菌感染的暴发流行，同时也存在散发流行。张婷等[16]对湖北省2012年分离出的35例霍乱弧菌进行的PFGE分型显示，同一地区菌株同源性为100%；不同地区间同源性为80%～100%，提示不同地区菌株存在一定变异。目前，PFGE技术在我国已普及应用至省市CDC，但罕有临床医师借鉴PFGE分析结果，因此须要提高临床医师对PFGE的认知并在临床诊治中进行推广。

2 PFGE在院内感染控制和诊治中的应用

PFGE分辨率高且重复性好，为分子分型的“金标准”，也是监测和控制院内感染的重要分型方法[17]。

2.1 PFGE在多重耐药铜绿假单胞菌（multidrug-resistant Pseudomonasaeruginosa,MDRP）院内感染中的应用日本Seki等[18]报道，2004年5—6月大阪一家教学医院8例重症监护病房患者出现MDRP医院获得性感染，患者均接受过经食管超声心动检查，结果在超声心动探头上分离出2种MDRP，将其进行PFGE谱型分析发现其PFGE图谱密切相关，从而证实这是一起由超声心动探头受MDRP污染所致的院内感染。医院采取相应消毒措施后，此后的8年内再未发生MDRP院内感染。

2013年，Kiddee等[19]报道泰国一家医院MDRP感染疫情，PFGE在确定菌株来源方面发挥了重要作用。

2.2 PFGE在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillinresistant Staphylococcusaureus,MRSA）院内感染中的应用代文霞等[2]报道，2003年10—11月北京儿童医院烧伤病房内4例患儿发生MRSA院内感染。患儿伤口分离的MRSA菌株与从患儿手和鼻腔以及床栏分离的MRSA菌株的PFGE谱型和耐药谱均相同，而从工作人员手机分离出的MRSA菌株PFGE谱型与前二者均不同。MRSA可能源于患儿自身携带，而与医务人员携带菌株无关。PFGE技术对阐明MRSA院内感染的来源发挥了决定性作用。

日本Takata等[20]报道，日本一家三级医疗机构对1987—2004年血标本分离出的MRSA进行PFGE分型，结果发现了104株MRSA流行菌株，33例散发菌株。

2.3 PFGE在产毒性大肠埃希菌O128：H45新生儿院内感染中的应用王红等[3]报道了一起经PFGE证实的产毒性大肠埃希菌O128：H45所致的新生儿院内感染暴发。2012年6月，我国四川省某医院新生儿科在短期内收治了多例症状相似的腹泻新生儿，主要表现为水样便、发热及呕吐。从患儿粪便标本及医院环境标本中分离出13株大肠埃希菌O128：H45和1株O55。O128：H45菌株间药敏结果相同，而与O55耐药谱明显不同。PFGE谱型分析显示13株大肠埃希菌O128：H45谱型相似性高于95%，为同一克隆菌株。O55菌株与13株大肠埃希菌O128：H45谱型相似性低于80%，非同一克隆菌株。通过询问流行病学史得知大部分患儿腹泻前48 h内曾到市妇幼保健院就诊，提示可能在妇幼保健院院内感染大肠埃希菌。

2.4 PFGE在其他院内感染中的应用PFGE亦被应用于多重耐药菌院内感染的研究，如宣迎梅[21]报道多重耐药鲍曼不动杆菌院内感染、Yu等[22]报道多重耐药肺炎克雷伯杆菌院内感染、Sun等[23]报道耐万古霉素肠球菌院内感染等。PFGE也可用于非耐药菌院内感染的监测，如Chiang等[24]和Merkier等[25]报道的黏质沙雷菌院内感染，MacFarquhar等[26]报道的链球菌院内感染。

PFGE用于院内感染监测，可判断有无院内感染流行，亦可协助判断院内感染源头及传播途径，为采取相应控制措施提供依据。

3 PFGE在复发性细菌感染诊治中的应用

对于同一部位连续多次发生同种细菌感染，PFGE分型显示谱型相同者为感染复发，药敏结果多与上次感染相同，可采用相同抗生素治疗；若PFGE谱型不同，则为新发感染。Luo等[27]对复发性尿路感染研究发现，52%的复发性大肠埃希菌泌尿系统感染为初次感染菌株持续存在，38%为非初次感染菌株。笔者在对导致腹腔感染的大肠埃希菌PFGE谱型的分析研究中发现，同一患者2次自发性细菌性腹膜炎（spontaneousbacterialperitonitis,SBP）分离出的大肠埃希菌同源性为97.4%，分离时间间隔28 d；另一位患者2次SBP分离到的大肠埃希菌同源性为76.9%，分离时间间隔6个月。提示一次SBP可能是新发感染，也可能是上一次SBP的致病菌未彻底清除，引起的感染复发。感染复发时2次感染的时间间隔较新发感染和上一次感染的时间间隔短。

4 PFGE在感染性疾病临床诊治中应用的展望

PFGE为大片段DNA的分离技术，因而不适用于病毒分型。有关PFGE在真菌感染中应用的报道很少，目前主要用于细菌分子分型。值得注意的是，并非每种遗传改变均可在PFGE图谱上得到反映，须结合其他分子分型的方法如多位点序列分析等，以及细菌学证据如血清型、耐药性等进行综合分析。

总之，PFGE在院内感染性疾病的诊治、感染性疾病的新发与复发鉴定、耐药性预测等多方面均有应用价值，应引起临床医师和医院管理部门的重视。

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（2014-03-12收稿 2014-05-22修回）

（责任编委 曲 芬 本文编辑 王 姝）

App lication of pulsed-field gel electrophoresis to the diagnosis and treatment of infectious diseases

LIYu-zhi,CHEN Zhi-hai*
Beijing Ditan Hospital,Capital Medical University,Beijing 100015,China
*Correspondingauthor,E-mail:chenzhihai0001@126.com

Pulsed-field gel electrophoresis(PFGE)is used as'gold standard'in the epidemiological analysis of outbreak of infectious diseases,and ismainly applied in the study of epidemiology of bacterial infectious diseases and molecular subtyping.PFGE also has a good prospect in clinical diagnosis and treatment of related infectious diseases,source tracking and control of nosocomial infections and so on.This review focuses on the application of PFGE to clinical practice.

electrophoresis,gel,pulsed-field;communicable diseases;cross infection

R446.112

A

1007-8134(2014)05-0308-03

北京市卫生系统高层次卫生技术人才培养计划（2011-3-079）

100015，首都医科大学附属北京地坛医院（李玉芝、陈志海）

陈志海，E-mail:chenzhihai0001@126.com