微生物全基因组测序在预防医学领域的应用

崔玉军，杨瑞馥

微生物全基因组测序在预防医学领域的应用

崔玉军，杨瑞馥

病原微生物引起传染病疫情时，预防医学工作者会面临以下几个重要问题：①病原从哪里来，可能的传播途径是什么；②病原有哪些生存能力、毒力和耐药特性；③病原所致疾病有着怎样的流行规律。高通量测序技术以及与之相伴的信息学分析技术的飞速发展，为上述问题提供了新的思路和解决方案。本文从流行病学调查溯源、病原体特性的快速判定、疾病流行规律分析以及疫苗变异监测和使用效果评价四个方面，总结归纳了新一代全基因组测序技术在预防医学领域中的应用实例，并对该研究方向存在的问题及未来发展进行了展望。

基因组；微生物学；序列分析；流行病学研究；病原

传染病疫情暴发严重危害人类健康，造成巨大的经济损失。尤其是新型病原微生物出现并迅速扩散时，如严重急性呼吸综合征、新型禽流感、德国出血性大肠杆菌疫情等，还会引起社会的普遍影响。预防医学工作者对疾病的流行规律，以及对引起疾病的病原微生物本身缺乏足够认识，是很多情况下疫情防控措施不够合理的重要原因；而缺乏对新型病原和疾病的了解，是导致民众产生恐慌的因素之一。因此，在疫情出现早期，快速获得病原特性，掌握疾病流行规律，是实现有效防控的重中之重。

对病原微生物的全基因组序列测定可以迅速提供疫情防控所需要的信息[1-4]。基因组是遗传物质的载体，也是形成微生物特定表型的本源。在疾病流行过程中，病原体的基因组会以一定速率发生变异，这些变异忠实记录了病原传播所经历的自然选择和遗传漂变的作用[5]。因此，测定病原微生物的全基因组序列，并应用比较基因组学和群体遗传学的分析方法研究这些序列及其变异情况，将能够预测病原微生物的重要表型，并反演病原传播的途径和选择压力。这些信息的获得将为针对性预防治疗和传播过程追溯提供必要的数据支持。

在过去30年中，基于基因组序列片段的分子分型方法与流行病学技术的结合极大地丰富了我们对病原的认识，脉冲场凝胶电泳、多位点串联重复序列分析、多位点序列分型（multilocus sequence typing,MLST）等技术已经在国家疾病防控体系中广泛应用。但是直到近十年前，分辨率最高的全基因组序列分析却始终徘徊在主流预防医学研究领域之外，其主要原因是基于双脱氧链终止法的第一代核酸测序技术成本过高，且进行全基因组测序的周期太长（通常需要整年的时间），不适合常规监测以及应对突发疫情的需要。2005年起，新一代测序技术走上历史舞台，将单个细菌全基因组序列测定所需的时间从1年缩短到几天甚至几个小时，测序成本也大幅度降低[6]，至此全基因组测序技术才真正跨越基础研究的范畴，开始走入预防医学临床应用的广阔天地，并为该领域的研究带来革命性变革[4，7]。本文从流行病学调查和溯源、病原体特性预测、疾病流行规律分析、疫苗变异监测和使用效果评价4个方面，对全基因组测序技术在预防医学领域中的应用进行综述。

1 流行病学调查和溯源

全基因组测序技术在预防医学中最直接的应用就是流行病学调查分析。病原体在不同宿主、媒介中复制和传播时，其基因组变异会以一定概率发生并累积下来。通过全基因组测序检测这些变异，并利用比较基因组学和群体遗传学分析手段重建样本间的系统发育关系，可以推测不同来源的病原体之间的传播关系，从而为流行病学和微生物法医学调查提供更完善的证据和补充。

此类研究最早应用于加拿大的一起社区胸膜结核疫情的回顾性流行病学调查[8]。该社区在2年时间里陆续观察到41例患者。Gardy等[8]对来自患者的结核分枝杆菌进行测序和系统发育分析，并与传统流行病学调查数据获得的患者社会网络互相叠加，精确判定了传染源和传播途径。研究发现了引起多人感染的超级传播者，并证明疫情实际由2起同时发生，但具有各自独立传播途径的流行组成。该研究首次将全基因组序列分析整合到传统流行病学研究中，有力证明了全基因组测序技术在流行病学调查中的作用。

全基因组测序的高分辨率特性使其在院内感染调查中起到不可替代的作用。2009年，英国剑桥医院的新生儿监护病房发生了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA）感染流行[9]。由于同一家医院的MRSA分离株遗传距离非常接近，传统分型方法无法检测出不同患者MRSA分离株之间的差异，也无法判断院内感染源头和传播途径。而结合全基因组测序分析以及菌株的分离时间等信息，研究者得以清楚区分暴发菌株和普通患者携带的非暴发菌株，从而排除非暴发菌株携带者对流行病学调查造成的干扰，确定疫情流行的过程。另一个典型例子是对碳青霉烯类抗生素耐药肺炎克雷伯菌院内暴发的分析[10]。该研究将全基因组序列分析结果与患者出、入院及住院病房等资料结合，鉴定出传染源是一例患者，并发现该患者通过3条独立的传播路径引起其他17例院内感染。其中有2条传播途径涉及到无症状携带者以及医院下水道、通风系统等，这是通过基因组学分析发现而被传统流行病学调查手段所忽略的。因此，基因组分析能够丰富传统流行病学研究结果，为制订有效防控措施奠定了科学基础。

全基因组序列分析还可应用于跨大洲的国际流行病学溯源研究。2010年10月，海地暴发了百年来首次霍乱疫情。疫情源头是来自拉丁美洲本地菌株还是联合国维和部队带来的外来菌株，曾一度引起强烈争议[11]。通过对2株暴发菌株进行测序，并与拉丁美洲流行株和亚洲菌株序列进行比较，研究人员初步得到了问题答案：海地霍乱暴发不是拉丁美洲当地菌株所致，而是由于人类活动从遥远的外地带入[12]。通过对更多暴发菌株及全球霍乱代表株进行全基因组序列分型（whole genome sequence typing, WGST），研究者发现南亚尼泊尔地区与海地的霍乱分离株WGST结果一致。尼泊尔分离的霍乱菌株可分为4个遗传发育分枝，海地暴发菌株是其中之一，与该分支其他尼泊尔菌株之间仅存在1或2个碱基的差异，证明海地霍乱暴发菌株来源于尼泊尔地区[13]。上述分析为WHO对海地霍乱流行病学调查的最终结论提供了坚实证据，成为认识疫情流行规律与实施有效防控措施的关键。

2 病原体特性的快速判定

通过对病原体全基因组序列的功能注释，以及与毒力因子数据库（http://www.mgc.ac.cn/VFs/main. htm）、耐药基因数据库（http://ardb.cbcb.umd.edu）等进行查询比对[14-15]，可以预测包括病原体环境生存能力、毒力及耐药谱等的重要表型特性，为临床用药给予指导。尽管表型试验成本相对较低，也容易在普通实验室实现，但基于全基因组序列的病原体特性预测对于新型病原体和生长速度非常慢的病原体仍然有非常高的实用价值。

2011年5—7月，大肠杆菌疫情在德国北部暴发，很快席卷整个德国和欧洲部分国家，并蔓延至美国和加拿大。合计感染人数达4000例以上，其中三分之一以上病例发展为溶血性尿毒综合征，超过50例死亡。尽管患者症状表现为典型的肠出血性大肠杆菌（enterohemorrhage Escherichia coli,EHEC）感染，但病原培养特性和MLST分析却发现暴发菌株与EHEC差距甚远，因此怀疑该菌株是一种新型致病性大肠杆菌[16-17]。我们在疫情暴发之初，应用Ion Torrent PGM测序仪3 d内完成了暴发菌株的测序，迅速确定了病原的性质[18]。将暴发菌株与当时已发表的30株大肠杆菌完成图序列进行系统发育分析，结果表明导致暴发的菌株与肠聚集性大肠杆菌属于同一进化分支，但由于获得了编码志贺毒素的stx2基因，从而表现出EHEC的致病特点。对暴发菌株序列的注释结果表明，该菌株还携带了Ⅰ型聚集性粘附菌毛蛋白等毒力因子，以及27个耐药基因和19个重金属抗性基因，其中耐药基因预测结果与德国科赫研究所公布的暴发菌株耐药表型谱高度一致。上述遗传因子可能增强了该菌株的环境生存能力，从而促进病原的大范围传播。以上研究结果为认清病原特性、制订针对性防控措施提供了重要依据，也为暴发菌株的特异性检测方案设计打下基础[19]。

抗生素耐药的全球扩散是WHO提出的威胁人类健康的全球三大首要问题之一，而结核分枝杆菌耐药性的研究一直是该领域的热点[20]。由于结核分枝杆菌生长速度极慢，通过传统培养和表型方法进行耐药谱检测，至少要花费几个星期。2013年新英格兰医学杂志上发表的一篇报道中，研究者将患者痰液放入分枝杆菌生长指示试管（mycobacterial growth indicator tube,MGIT）中进行培养，3 d后直接从培养物中提取DNA，并使用IlluminaMiSeq测序仪进行测序[21]。结果鉴定出患者混合感染了2种不同的结核多耐药菌株，并通过耐药基因的变异情况预测了耐药谱。通过序列分析获得的耐药谱准确包含了参考实验室通过培养检测得到的全部9种抗生素的耐药情况，并预测菌株可能对另外5种抗生素耐药（参考实验室未进行实验验证）。这项研究利用全基因组测序技术，将结核分枝杆菌耐药谱检测时间从几个星期缩短到几天，其推广应用将为结核分枝杆菌耐药的临床诊断带来革命性变化。

3 疾病流行规律分析和预测

使用群体遗传学方法，对病原体的历史分离株进行全基因组序列分析和进化研究，可以推测病原的长期流行情况，深入认识其所致疾病的流行规律。

流感是最常见的呼吸道传染病，每年在全球造成几十万人死亡。通过北半球（美国纽约）和南半球（新西兰）在12年间分离的上千株甲型流感病毒的序列分析，Rambaut等[22]提出了流感流行的“源库模型”（source-sinkmodel）。他们推测，流感病毒的遗传多样性在位于热带地区的宿主种群中（source）持续产生，并在强烈的自然选择作用下发生抗原漂变等变异。随后，在热带地区变异后的流感病毒季节性传播到南北半球的温带地区（sink）并在当地造成流行。因此，要从根源上遏制流感疫情，不仅要对流行区域进行疫苗接种等防控措施，还须要重视对热带地区流感宿主种群的研究。

鼠疫菌是对人类历史影响最深远的病原之一，曾导致3次世界范围的大流行。但由于缺乏病原学证据，前2次大流行（公元6世纪的查士丁尼瘟疫和14—17世纪的中世纪黑死病）是否为鼠疫菌所致在学术界一直有争议。直到近年来，通过对死于前2次瘟疫的患者尸骨中提取的古DNA进行全基因组测序，才为这些争议盖棺定论[23-24]。分析结果显示，古DNA与现代鼠疫杆菌在核心基因组上仅存在几百个单碱基差异，证明2次流行确实是鼠疫杆菌所致。造成2次流行的鼠疫杆菌分属于不同的进化分支，其中引起第1次大流行的分支已经在进化长河中消失；而引起第2次大流行的分支被保留下来，其后代在进化了几百年后又导致了第3次世界大流行[24]。对全球代表性鼠疫杆菌分离株的全基因组测序和分析进一步加深了我们对鼠疫流行规律的认识。研究结果表明鼠疫可能起源于中国青藏高原东部，并通过丝绸之路、茶马古道和唐蕃古道等古商贸途径传播到世界其他地区，说明人类活动在鼠疫传播中起到重要作用[25-26]。

通过适当的数学方法对病原体基因组变异进行解析，可以推测产生变异的系统发育过程，以及进化传播过程中的各种重要参数，包括传播速度、基础复制率、采样比率、有效种群大小等。Stadler等[27]应用基于贝叶斯方法开发的存亡轮廓线模型（birth-death skyline plot,BDSP）对HIV基因组序列进行分析，重现了由于成功应用鸡尾酒疗法，英国的B型HIV-1有效复制率和种群多样性在20世纪90年代开始呈现明显下降的趋势；并指出在90年代中期之后，由于高效抗反转录病毒疗法的产生，HIV的有效复制率开始低于1，提示流行趋势已得到控制。该方法还被应用于63株埃及分离的HCV的序列分析，结果清晰显示了20世纪初由于抗血吸虫注射疗法造成埃及HCV感染急剧增加，而在70年代之后，由于口服疗法逐渐取代了注射疗法，HCV感染率及有效种群也随之下降[27]。BDSP方法从数学层面将基因组序列变异和疾病流行规律结合起来，在将来疾病流行趋势分析中将发挥重要作用。

4 疫苗变异监测和使用效果评价

利用全基因组序列分析，我们还可以对疫苗株的变异及使用效果进行监测和评价。EV76是鼠疫耶尔森菌减毒活疫苗，曾在世界范围内应用于鼠疫预防接种。通过对中国保藏的EV76-CN株进行全基因组测序，并与鼠疫杆菌野生株进行比较分析，我们鉴定出疫苗株发生了12个突变（6个单核苷酸多态性和6个插入缺失）。选择更多来自不同研究所和国际保藏中心的EV76疫苗株，对这些突变位点进行了扫描，结果发现该疫苗在各个国家之间转移、运输和生产的过程中，至少已形成5个种系，并发现中国使用的EV76株存在3个独立的来源[28]。基因组水平的遗传变异可能导致疫苗株表型变化，进而影响接种后的免疫效果，因此我们的发现将有助于阐明各批次疫苗的免疫效力不同的问题，为疫苗的质量监测提出了新的思路。

美国从2000年开始，大范围应用肺炎球菌脂多糖-蛋白质联合七价疫苗（PCV7）。与此同时，能逃避疫苗的肺炎链球菌菌株在种群中的频率开始上升。2012年，Golubchik等[29]通过对62株19A血清型肺炎链球菌的测序分析表明，同源重组造成关键遗传片段在菌株间的水平转移，是导致疫苗逃避的最重要原因。研究还发现，在重组造成荚膜转换，从而逃避疫苗作用的同时，大量其他未知功能的基因组片段也通过搭车效应转移到受体菌中。因此，疫苗的大规模应用会对细菌种群的进化产生一些难以预料的后果。2013年，Croucher等[30]进一步研究了肺炎链球菌种群在疫苗作用下的进化机制，通过616株无症状携带者分离的肺炎链球菌基因组序列比对，研究者在荚膜生物合成基因簇、抗原蛋白编码基因PspA和PspC等基因元件中观察到了显著的重组事件。结合近十年的流行病学资料进行综合分析发现：重组对整个种群的血清型转换和耐药谱产生了影响，受到免疫的7个血清型几乎完全消失，取而代之的是非疫苗免疫的型别。但接种疫苗前后物种的基因库基本没有发生变化，因此尽管儿童患病率显著下降，肺炎链球菌的无症状携带者比例与疫苗使用前相比无显著差别。以上研究让我们了解到大规模疫苗接种行为对病原体种群组成的影响，这为将来疫苗的针对性设计提供了依据。

5 问题与展望

尽管已经在预防医学领域取得了显著进展，但全基因组测序技术要真正进入基层疾病监测机构和医院，仍然有很长一段路要走。首先要解决的是成本问题。目前上市的测序仪主要为人类基因组研究设计，而普通细菌基因组大小仅为人类基因组大小的千分之一。进行微生物基因组测序时，为了降低成本，往往须要把几十甚至上百株样品的DNA加上标签后混合测序。这对于群体遗传学研究是非常合适的，但限制了其在临床上的应用。第二个要解决的问题是测序前样本的快速处理。如果按照传统测序方法，先对菌株进行复苏培养，再大量提取DNA进行测序，其整个周期将仍然很长，难以体现快速全基因组序列分析的优势。尽管已有一些实验室解决方案被提出，如上文中提到的利用MGIT方法对结核分枝杆菌快速培养测序[21]，以及在非培养条件下，对样本DNA进行富集后测序[31]，或者直接进行宏基因组或者单细胞测序等[32-33]，但这些方法的大规模临床应用还存在技术和成本屏障。第三个问题是海量数据的储存管理及自动化分析。高通量实验技术使得数据产生相对容易，而对数据的解析和管理成为科研的瓶颈。尤其对于疾病防控工作者和医生来讲，在日常工作中去对大量数据进行深入分析是不现实的，必须开发数据库和自动化分析平台，实现从序列到结果解读的“一键化”操作。

可以设想未来传染病防控工作的一个场景：工作人员采集到患者体液样本，在实验室经过简单处理和平板培养，长出单菌落后，将其分成两部分，一部分用于提取DNA测序，另一部分继续培养，进行表型试验。几个小时内获得测序结果后，可直接导入普通笔记本电脑预装的软件（或网络分析平台），软件在几分钟内自动给出标准格式的病原特性和溯源分析报告。测序分析结果与表型试验相互印证，为患者临床治疗和疾病流行控制提供迅速有效的指导。这个场景令人鼓舞与期待。

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（2014-07-25收稿 2014-08-01修回）

（责任编委 毛远丽 本文编辑 王 姝）

Application ofm icrobialwhole-genome sequencing technology in the area of preventivemedicine

CUIYu-jun,YANG Rui-fu*
State Key Laboratory of Pathogen and Biosecurity,Beijing Institute of Microbiology and Epidemiology,Beijing 100071,China
*Corresponding author,E-mail:ruifuyang@gmail.com

When being faced with infectious disease caused by a specific pathogen,several immediate questions need to be addressed to make effective prevention and control strategy.Firstly,where does the pathogen come from,and what is the possible transmission pathway?Secondly,what are the surviving,virulent and antibiotic resistance features of the etiologic agent?Thirdly, what kind of epidemiological pattern of a disease is revealed by the pathogen's genomic analysis?Dramatic development of highthroughput sequencing technology and bioinformatic analysis strategy has provided novel solutions to these questions in recent years. In this review,the authors summarize the successful application cases of the next-generation whole-genome sequencing technology in the area of preventive medicine,including epidemiological investigation for source-tracing,rapid identification of pathogen's features,epidemiological characteristics of a disease,and surveillance and evaluation of live attenuated vaccine variations,and also discuss the questions presenting in current stage and propose the possible scenario of this research area in the future.

genome;microbiology;sequence analysis;epidemiologic study;pathogen

R394.21；R37

A

1007-8134(2014)05-0274-05

国家“十二五”科技重大专项（2012ZX10004215）；国家卫生行业科研专项（201202012）

100071北京，军事医学科学院微生物流行病研究所病原与生物安全国家重点实验室（崔玉军、杨瑞馥）

杨瑞馥，E-mail:ruifuyang@gmail.com