基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术在感染性疾病病原及耐药检测中的应用

毛远丽，秦建成，李波

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术在感染性疾病病原及耐药检测中的应用

毛远丽，秦建成，李波

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术作为蛋白质组学分析方法，具有高通量、高敏感度、操作简单、快速获得结果、可自建数据库等特点。该技术应用于感染性疾病病原鉴定及耐药检测，对临床感染患者的及时诊治意义重大。本文通过介绍该技术对菌种、无菌部位等各类标本的病原微生物进行快速鉴定及耐药检测的研究现状，探讨其面临的挑战和应用前景。

光谱法，质量，基质辅助激光解吸电离；细菌学技术；传染病

自20世纪80年代初，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption ionization time of flightmass spectrometry,MALDI-TOFMS）就已成为一个用于研究与分析蛋白质特征的有力工具。近年来各种科技的发展使其能够对核酸、蛋白质、多肽等生物大分子进行微量分析。在疾病诊断与发生发展研究中，质谱技术在生物标志物的发掘和鉴定[1-2]、病原微生物的鉴定和分型[3]、靶蛋白的组织定位[4]等方面都有了初步研究结果。在这些研究中,MALDI-TOF-MS针对细菌鉴定的研究和应用报道最早[5-6]，并已率先应用于感染性疾病病原体临床分离菌株的鉴定与分型。该技术打破了传统的繁琐鉴定流程，大大缩短了检测时间，降低了检测成本。当前MALDI-TOF-MS在感染性疾病细菌或病毒病原的诊断与应用研究中的焦点在以下方面：①培养纯菌落的鉴定；②无菌部位样本中细菌的直接鉴定；③细菌耐药性的检测；④病毒的检测。

1 MALDI-TOF-MS原理和特点

MALDI-TOF-MS仪器主要由两部分组成，即基质辅助激光解吸电离离子源（matrix-assisted laser desorption ionization,MALDI）和飞行时间质量分析器（time of flight,TOF）。MALDI的原理是待检样品与基质混合形成共结晶薄膜，利用激光作为能量来源照射结晶体，基质将激光中吸收的能量传递给待检样本中的生物分子，发生生物分子电离形成离子。TOF的原理是离子在加速电场下获得相同的动能，电场作用下经高压加速、聚焦后进入飞行时间检测器，根据到达检测器的飞行时间不同，以检测到的离子峰强度为纵坐标，以离子质荷比（m/z）为横坐标，进行质量分析，形成质量图谱。通过与已建立的图谱库或相应软件分析进行比较，确定出特异性指纹图谱，完成待检样本中生物分子的区分和鉴定[7]。这些原理使MALDI-TOF-MS能完成多种成分（包括蛋白质、脂类、脂多糖和脂寡糖、DNA、多肽及其他能被离子化的分子）的分析[3-4，8]，同时具有样本制备方便、实验操作简单、数据库可不断扩展等优点，可实现样本微量化、高通量检测和结果自动分析，检测过程从上样到结果报告可在数分钟内完成。

2 MALDI-TOF-MS在细菌感染性疾病病原及耐药检测中应用

2.1 培养纯菌落的鉴定MALDI-TOF-MS技术应用最广泛、最成熟的是鉴定临床标本分离培养的细菌纯菌落。目前已有经FDA和SFDA批准的质谱仪及相应的质谱数据库，可覆盖包括革兰阴性菌、革兰阳性菌等临床常见细菌以及真菌的不同菌属及菌种。Benagli等[9]用MALDI-TOF-MS与Phoenix、API和16S rDNA序列分析方法对1019株菌进行比较研究，证明加德纳菌、屎肠球菌和粪肠球菌等与其他常规方法的鉴定一致率分别为97.4%、100%和100%，其结果与16SrDNA序列分析几乎完全吻合。但是鹑鸡肠球菌和链球菌属的鉴定一致率较低，分别为44.4%和78.9%。国内学者用MALDITOF-MS鉴定27个菌属和73个菌种共计1665株革兰阴性菌，在属和种水平上与Vitek 2鉴定结果的符合率埃希菌属为99%和99%，克雷伯菌属为95%和90%，假单胞菌属为94%和89%，沙雷菌属为93%和88%，肠杆菌属为93%和73%，并将细菌鉴定时间由16～18 h缩短到3～5min。而鉴定气单胞菌、弧菌和沙门菌在种的水平结果不理想，符合率仅为37%、27%和0[10]。Seng等[11]用MALDI-TOFMS对1660株临床分离菌株（包括45个菌属和109个菌种，每种有1～347个不同的菌株）进行检测，并通过16S rRNA和rpoB基因测序确定。结果显示，MALDI-TOF-MS的鉴定准确率≥95%，其中属的鉴定水平达95%，种的鉴定水平在84%以上。另外，已有成功建立宋内志贺菌的质谱库并用于临床菌株鉴定的研究报道[12]。MALDI-TOF-MS技术对有些微生物如链球菌属和嗜麦芽窄食单胞菌的鉴定不尽人意，可能与细菌之间的亲缘关系相近或特殊蛋白指纹图谱峰的特征性不明显有关，须要在实际临床应用中不断探索[13-14]。

2.2 无菌部位和尿液样本的直接检测MALDITOF-MS用于鉴定细菌分离菌株显著缩短了报告时间，为临床重症感染者的及时救治起到重要作用。如果实现用感染者无菌部位经培养的样本直接进行细菌鉴定，可以进一步缩短时间。早在2009年La Scola等[15]就尝试利用MALDI-TOF-MS直接从阳性血培养样本中鉴定病原微生物，但由于血液样本中多种成分的影响未获成功。Ferroni等[16]和Prod'hom等[17]对需氧和厌氧血培养阳性报警瓶进行前处理，通过细胞溶解以及差速离心分离等步骤来分离细菌和宿主蛋白，在30min内就可完成鉴定，在细菌种水平上的鉴定正确率达到75%～95%。Haigh等[18]分别用富集法和Sepsityper商品试剂盒对350个血培养阳性瓶样本直接进行处理，采用MALDI-TOFMS进行快速鉴定。整个实验在30min内均可完成，结果除53个混合性细菌未能鉴定外，总体正确率分别为74%和77%。其中，鉴定革兰阴性菌的正确率分别为91%和88%，鉴定革兰阳性菌的正确率分别为14%和36%，可能与该研究的菌种组成有关。Lee等[19]用MALDI-TOF-MS直接对尿液样本鉴定腐生葡萄球菌，并与目前通用的鉴定系统包括BD公司的phoenix鉴定仪、梅里埃公司的Vitek 2鉴定仪和MicroScan鉴定系统比较。通过16s rRNA和rpoB基因测序确定，鉴定正确率分别为100%、86.7%、86.7%和93.3%。Ferreira等[20]用MALDI-TOF-MS联合UF-1000I流式细胞仪直接对220例细菌含量大于105CFU/ml的尿路感染标本进行细菌鉴定，结果对最常引起尿路感染的大肠埃希菌在种水平上的鉴定正确率分别为91.8%和92.7%。多数研究结果表明，当患者为单一菌感染和菌落计数达105CFU/ml时，MALDI-TOF-MS种属鉴定准确率可以达到90%以上，而对于混合性细菌感染尿液样本的鉴定，其鉴定正确率会大大降低。尽管Nyvang Hartmeyer等[21]报道了用MALDI-TOF-MS在30min内快速鉴定出1例患者脑脊液标本中肺炎链球菌的结果，目前该技术对胸水、腹水、脑脊液、脓液等标本的直接检测的相关报道还比较少，应用于这些无菌部位体液中病原的直接鉴定还有待于进一步探索。

2.3 细菌耐药性检测MALDI-TOF-MS对耐药细菌的检测潜能正在被逐渐挖掘。多数研究采用以下方法：①寻找耐药菌株与敏感菌株间的特征性蛋白和图谱峰；②通过耐药菌株与抗生素共培养，然后检测分解产物。对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA）和甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（methicillin-sensitive Staphylococcusaureus,MSSA）的检测研究较多且较为成熟[22-23]。Edwards-Jones等[24]在对金黄色葡萄球菌的耐药研究中发现，MRSA的质谱图中多个峰值（82～209）显著高于MSSA（37～67）的峰值，且MRSA和MSSA都有各自的特征峰，MRSA菌株蛋白质指纹图谱特征峰主要位于500～2000m/z的小分子量范围内[22]。Majcherczyk等[23]研究显示，MALDITOF-MS能够区分基因型相同的不同耐药性菌株，主要就是根据不同耐药性菌株所具有不同的特征性图谱。Wolters等[25]对MRSA中的青霉素结合蛋白PBP2a检测的研究结果表明，通过寻找耐药菌株的特征性蛋白也可以确定耐药菌，如可迅速确认金黄色葡萄球菌中甲氧西林耐药表型。MALDI-TOF-MS用于检测产β-内酰胺酶和碳青霉烯酶的耐药菌，通过耐药菌株与酶抑制剂抗生素共培养1～3 h，产生足以被质谱仪检测到的酶切产物，然后检测分解产物，从而间接证明耐药酶的存在。采用此方法已成功检测到对氨苄西林、哌拉西林、头孢曲松和头孢他啶耐药的肠杆菌科细菌及产NDM-1、VIM-1、KPC、OXA-48和OXA-162型碳青霉烯酶的细菌[26-29]。

2.4 病毒感染的检测常规的实验室病毒主要是检测病毒的特异性抗原、抗体或核酸片段，多采用ELISA、PCR等技术。质谱技术的发展为病毒感染的快速诊断提供了新的选择。目前多数研究通常采用PCR技术和MS技术相结合，通过对扩增产物目的片段进行质谱检测，或通过比较酶切片段质荷比的变化进行分型，通常MALDI-TOF-MS可以分辨出5Da以下的质量差异，而核酸之间的质量差异通常在10Da以上，所以MALDI-TOF-MS对核酸的检测比传统的电泳技术灵敏度高。

Sjöholm等[30]采用MALDI-TOF-MS技术直接检测血清和无菌体液等样本中的多种疱疹病毒（包括单纯疱疹病毒、带状疱疹病毒、巨细胞病毒、人类疱疹病毒6、7、8及疱疹病毒B型），与多重PCR检测的一致性达95%；病毒含量在5～100 copies时的灵敏度达100%，特异度达92%～100%，特别适合于大规模流行病学研究及人群筛查。Chou等[31]的研究结果显示，MALDI-TOF-MS技术用于检测流感病毒也具有较好的准确性及灵敏度。研究者将磁性纳米粒子-抗体复合物与MALDI-TOF-MS技术相结合进行流感病毒H5N2的检测，1 h内完成，灵敏度达103EID50/ml。还有研究用MALDI-TOF-MS技术与多重PCR结合，同时检测人类8种不同肠道病毒（包括戊型肝炎病毒、柯萨奇病毒、脊髓灰质炎病毒、星状病毒、诺如病毒、埃柯病毒、肠病毒71、呼肠病毒），在病毒含量为100～1000 copies时，诊断特异度达100%；对多重感染诊断具有很好的应用价值[32]。Yi等[33]利用GP5+/GP6+引物扩增L1基因区片与MALDI-TOF-MS技术结合，可鉴定14种高风险的人乳头瘤病毒，灵敏度为10～100 copies/ml，24 h可完成4500个标本检测，并且与低风险HPV型无交叉反应。该方法的另一个优势是可以通过增加引物种类而检测新的型别，具有很好的临床应用前景和大范围流行病学调查价值。

病毒变异是临床抗病毒治疗的棘手问题，目前已应用MALDI-TOF-MS的核酸分析技术进行HBV和HCV的血清分型，并可以检测病毒的变异，区分野生株和突变株，指导临床用药。该方法具有快速及低成本的优点，但缺点是只能用于HBV的 B和C型[34]。Hong等[35]采用MALDI-TOF-MS方法进行HBV的YMDD变异位点的检测，该方法具有更高的灵敏度和特异度，并且可以对HBV感染者抗病毒药物治疗效果进行监测。另外，MALDITOF-MS用于HCV分型及抗病毒药物耐药检测的研究也有文献报道[36-39]。

3 问题与对策

尽管质谱技术在感染性疾病病原微生物鉴定的研究和应用领域已取得了显著成绩，但在临床应用中还存在诸多须要研究和解决的问题，须要我们在应用过程中不断加以改进和完善。首先，质谱数据库的资源不足、鉴定病原的种类受到数据库的限制是制约质谱技术应用于临床的主要因素[40]。目前,各型号质谱仪的数据库资源都是有限的，如Bruker公司的MICROFLEXTM，UITRAFLEXⅡTM,AUTOFLEXTM和BIFLEXTM等型号的质谱仪数据库中，拥有的芽孢杆菌属和乳酸杆菌属的数据比较庞大，但沙门菌却仅有16个种，而且没有志贺菌、布鲁氏菌以及霍乱弧菌的相关数据及图谱。Micromass公司的MALDI-Liner飞行时间质谱仪数据库内含有志贺菌的数据资源，但是芽孢杆菌属的数据比较少。虽然质谱仪器公司也先后推出了配套质谱图分析软件（如BioTyper、Mascope等），但数据库的及时更新与补充仍是一个难题。利用一定数量的标准菌株和已知临床分离菌株补充和更新菌株数据库，必要时可考虑对某些菌种建立本地区性的数据库，甚至可以建立多地区数据库联网共享，以解决错误鉴定、无法鉴定及低分鉴定等问题。第二，待检样本的处理方法没有标准化是导致获得的质谱图峰信息存在差异的主要因素之一。因此，针对不同种类的菌属应有不同的培养条件及检测参数的设置，对于某些可直接检测的样本，应选择合适的预处理方法。本实验室应用Microflex-LT质谱仪已完成各类细菌、真菌及分枝杆菌等近2万多株临床菌株的鉴定，在工作中积累了较多经验。对于临床分离菌株的样本，菌种的纯度、菌浓度、基质液的选择以及涂抹到载体的均匀度都会影响MALDI-TOF-MS对菌株的鉴定正确率。例如，黏液性的肺炎克雷伯菌经常会有无法鉴定的结果，当涂抹细菌时做到尽量薄、均一，就可以达到较好的鉴定结果。又如对于酵母菌、链球菌、棒状杆菌等的鉴定，如果使用直接涂抹法，在靶板上涂抹菌液后加1μl70%的甲酸，然后再加基质，可提高此类菌的鉴定率。对于血培养阳性瓶直接检测的标本，更应对标本采集、培养瓶基质、样本去红细胞、蛋白沉淀、蛋白提取和溶出等样本预处理的关键环节建立起规范化程序，并在实际工作中不断完善。第三，MALDI-TOF-MS技术在细菌耐药检测的研究尚处起步阶段，应用于临床还需要很多工作他方法进行研究，包括建立不同耐药机制的检测方法和耐药库，以扩展、完善、标准化质谱技术在细菌耐药方面的检测。同时由于基因扩增和序列分析技术用于病毒核酸、分型、变异以及耐药检测在临床实验室已日趋成熟，使MALDI-TOFMS技术的应用受到一定限制。第四，与细菌鉴定比较，采用MALDI-TOF-MS技术检测病毒还存在一定的局限性。①MALDI-TOF-MS通常是检测待检样本经PCR扩增后的核酸片段，与细菌鉴定相比，采用质谱检测在时限性上没有明显的优势；②检测的结果受PCR的影响，引物的设计要求比较高，尤其是高通量检测多个病原；③质谱检测对样本的纯度要求很高，PCR体系中的离子会影响质谱检测的分辨率和信号强度，因此样本须要进行纯化，这使得检测的过程更加复杂[32，36]。

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（2014-08-26收稿 2014-09-12修回）

（责任编委 李 军 本文编辑 王 姝）

The application of thematrix-assisted laser desorption ionization time of flightmass spectrometry in the infectious disease pathogens and drug resistance detection

MAO Yuan-li*,QIN Jian-cheng,LIBo
Clinical Laboratory Center,302 Hospital of PLA,Beijing 100039,China
*Corresponding author,E-mail:maoyuanlee@163.com

Matrix-assisted laser desorption ionization time of flightmass spectrometry（MALDI-TOF-MS）works as amethod for proteomics analysis with characteristics of high throughput,high sensitivity,simple operation,quick results and the self-built database.This technology has been applied in infectious disease pathogen identification and detection of drug resistance,and is of great significance to timely diagnosis and treatment.By introducing the research status of the technology in its quick identification and drug resistance detection of pathogenic microorganisms of such specimens as strains and sterile,this paper discusses its challenges and application prospects.

spectrometry,mass,matrix-assisted laser desorption ionization;bacteriological techniques;communicable diseases

R313

A

1007-8134(2014)05-0270-05

国家“十二五”科技重大专项（2012YQ180117）

100039北京，解放军第三○二医院临床检验医学中心（毛远丽、秦建成、李波）

毛远丽,E-mail:maoyuanlee@163.com