分子诊断技术在传染病病原体检测中的应用

王升启

·导向与述评·

分子诊断技术在传染病病原体检测中的应用

王升启

传染病病原体的准确检测是传染病有效防控的前提，也是合理用药的基础。然而，传统的病原体分离、培养等诊断方法不能完全满足临床治疗和疾病控制的需要。新发展的传染病分子诊断技术可有效弥补传统方法的不足。本文就新一代测序、核酸扩增、生物芯片和生物传感等传染病分子诊断新技术及其应用研究进展进行综述。

分子诊断技术；基因扩增；高通量核苷酸测序；微点阵分析；生物传感技术；传染病

本文对新一代测序、生物芯片、核酸扩增和生物传感四类分子诊断技术进行综述。

1 新一代测序技术

1.1 病原体培养物样本的基因组测序获得病原体整个基因组，是最精确的病原体确证手段。从感染病例分离培养的病原体经过核酸提取、文库构建以及定量质控后，通过新一代测序技术可以快速得到病原体基因组，从而实现对病原体的精确鉴定，快速发现基因组标志物用于检测试剂盒的研发，非常有利于突发疫情的快速反应。同时，通过病原体基因组信息可实现溯源分析和耐药/毒力基因分析，深入解析疫情传播机制。2011年5月，德国出现出血性大肠杆菌O104:H4疫情。华大基因在获得培养菌株的核酸后，3 d完成了7次二代测序实验，5 d后O104:H4菌株的基因组草图就在NCBI核酸数据库公布。基于该数据2 d后便研发出了诊断试剂盒，并在2周内由全球研究人员发布了24篇研究报告（毒力、耐药、进化等），极大促进了该疫情的防控[1]。同年7月，荷兰暴发由超级耐药肺炎克雷伯菌Oxa48株导致的疫情，德国明斯特大学获得样本2 d后，便完成2株细菌的全基因组测序，并迅速发现特异序列用于临床排查试剂盒的开发。Science杂志对新一代测序技术在这两场疫情中发挥的作用给出了高度评价，指出新一代测序技术已成为基因组时代应对突发公共卫生事件的主流技术[2]。然而，由于新一代测序技术的高成本和复杂度，目前还不能在一线临床机构如医院检验科进行推广。如今，各测序仪厂商都在积极进行临床申报，但是自动化建库工作站和数据分析软件等配套系统都亟待完善。高通量测序全面用于临床病原体确认还需要一定的时间。

1.2 非培养样本病原体的检测新一代测序技术还可用于非培养样本病原体的检测。由于新一代技术不需要对病原体有预先假设，非常适合非培养样本中“未知”病原体的检测，可实现其他技术无法克服的检测难题。但是，样本中绝大部分为宿主和正常菌群的核酸背景，病原体信噪比极低，须要依赖先进的样本处理和生物信息学技术实现大海捞针式的病原体检测工作，具有较大的挑战性。2008年，瑞典斯德哥尔摩Karolinska医学院的医生和研究者遇到1例疑难病例，3例接受了来自同一供者器官的移植手术患者，在手术后4～6周均持续发热并相继死亡，而且并无明显的免疫反应。采用常规细菌和病毒培养、多种病原体PCR检测试剂盒以及病毒和细菌病原体微阵列芯片都未发现可疑病原体。于是，研究者从2例患者组织中提取了RNA，采用454测序仪进行新一代测序，经一系列生物信息学过滤和分析后，最后发现14条组装片段同旧世界沙粒病毒（old world arenaviruses）序列同源（约80%同源性），后经多种生物实验手段验证后，确证了该病毒病原体在3例患者体内广泛存在[3]，该项工作也成为新一代测序技术鉴定“未知”病原体的开山之作[4-5]。之后，多家机构采用该研究思路，也发现或确证了多种传染病病原体[6-9]。新一代测序技术还被用于疑似病例的病原体排查。如2012年，斯坦福大学研究者对乌干达123例疑似登革热患者血清进行新一代测序并最终确证37%的阳性患者（登革热病毒占仅总样品量的0.002%～2.800%）[10]。然而，这类工作目前还主要停留在从非培养样本中得到病原体的基因组片段，而从非培养样本中直接得到病原体整个基因组还存在较大的挑战[11]。由于技术的挑战性，新一代测序全面用于临床非培养样本检测的可能性较小。但是，通过一线临床工作者和研究人员密切合作，利用新一代测序解决疑难感染病例问题，具有较高的可行性。

2 生物芯片技术

生物芯片技术是指通过微加工技术在平方厘米大小的固相介质表面或液相介质中构建微型分析系统，根据分子间特异性相互作用的原理，实现对蛋白质、核酸等分子的准确、快速、高通量、平行化和自动化检测[12]。基因芯片、蛋白质芯片和芯片实验室都属于生物芯片的范畴[13]。与传统的检测技术相比，生物芯片具有准确、快速、高通量的优势，在病原微生物感染鉴别诊断、基因分型及耐药检测等传染病分子诊断领域应用广泛[14]，目前已有多种生物芯片产品获批应用于临床诊断。

2.1 病原微生物感染鉴别诊断病原微生物种类众多，临床和疾病控制中心都存在感染鉴别诊断的需求。生物芯片技术具备高通量的优势，可同时检测多个标志物，筛查多种病原体，目前已有多种产品问世[15]。丙型肝炎分片段抗体检测蛋白芯片，选取HCV核心抗原NS3/NS4/NS5为检测探针，经过3家单位临床考核证明与ELISA法符合率达99%，且准确性高于ELISA法，与RIBA试剂符合率为98%，可用于HCV的感染确证[16]。这是国际上第一个基于硅基材料的获得注册证书的市场准入生物芯片产品。

2.2 病原微生物基因分型同种病原微生物不同基因型可导致疾病及预后的进展不同[17]，因此，针对型特异性核酸序列利用生物芯片技术进行基因分型具有重要意义。如HBV基因分型检测试剂盒（基因芯片法），可区分A～G共8个基因型别[18]，可用于人血清或血浆样本中HBV的基因分型检测。尽管分子分型中基因测序是“金标准”，但基因芯片技术与测序技术相比的优势在于灵敏度高，如一些含量较低的微生物，从原始标本中直接扩增出可满足测序要求的基因片段有较大困难，但应用了信号放大的基因芯片技术可以完成低拷贝数模板的检测。

2.3 病原微生物耐药检测生物芯片技术不仅可检测特异性基因，还可用于检测单核苷酸多态性，已有多种微生物耐药检测产品问世[19]。如HBV核酸及YMDD变异检测基因芯片试剂盒，可同时分析HBV多聚酶突变位点528、552及555突变，共检测了2425例血液标本，芯片结果与测序结果的符合率为98.1%，这是国际上第一个HBV耐药检测基因芯片，可为临床医师提供HBV感染者的抗病毒用药参考[20]。结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒（DNA微阵列芯片法），可检测利福平和异烟肼的3个耐药相关基因rpoB基因、katG基因及inhA基因启动子的野生型及不同突变型，用于定性检测来源于临床疑似结核病患者经过分离培养的结核分枝杆菌分离株样本中的核酸及药物敏感性（药敏）情况，在脊柱结核标本检测中，该芯片检测利福平耐药的灵敏度和特异度分别为88.9%和90.7%，检测异烟肼耐药的灵敏度和特异度分别为80.0%和91.0%[21]。该方法与传统的结核菌培养和药敏实验相比，可提前至少4周报告结果，对疑似结核病患者的早确诊和早治疗具有重要意义。

2.4 生物芯片信号检测技术生物芯片技术在传染病检测领域具有广阔的应用前景，但现有芯片技术灵敏度低和设备要求高是推广应用的瓶颈。在此背景下，芯片技术的信号检测领域近年来也取得了一些研究进展。基于有机荧光的芯片信号检测方法成熟、简便，能够达到一般的检测要求。但荧光芯片也存在缺点，如荧光易淬灭、检测灵敏度不足，且信号检测需要激光共聚焦扫描仪等特殊仪器。Wang课题组发明了一种新型纳米金复合底物Nanogold-DAB，HRP，能够直接催化此复合底物反应使大量纳米金特异沉积，再通过银染色增强，建立起可视化生物芯片检测方法[22]。该技术不仅提高了检测灵敏度，而且也实现了检测仪器的低成本化、小型化，有利于生物芯片技术的推广应用，预计2015年会有系列可视化生物芯片产品获准上市。

3 核酸扩增技术

3.1 实时荧光PCR检测技术实时荧光PCR检测技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，因其准确、快速、灵敏等特点被国际公认为传染病相关病原微生物实验室确证的最有效手段，获批产品众多，近年来该技术在新突发疾病（严重急性呼吸综合征、甲型H1N1流感等）的确证、常规病原体的检测和诊断中均发挥了不可替代的作用[23-24]。

荧光PCR的化学原理可分为3个基本类型：DNA结合染料法、探针法和猝灭染料引物法[25]。前2种方法均可检出引物二聚体等非特异反应产物，特异性不强，因此在传染病的临床诊断中应用极少。在传染病的分子诊断中一般建议采用探针法。探针法依赖荧光共振能量迁移实现检测，包括TaqMan探针、分子信标、蝎型探针和复合探针等，该法仅检测特异性扩增产物，因此特异性强。目前应用最广泛的为TaqMan探针技术，WHO公布的甲型HIN1流感及人感染H7N9禽流感防控指南中推荐的荧光PCR检测方法均采用的是TaqMan探针技术。复合探针技术是国内惟一具有自主知识产权的荧光PCR方面的核心探针技术，具有噪声信号低、灵敏度高等优点，目前该课题组基于该技术已开发出了系列的传染病诊断试剂。

3.2 核酸等温扩增技术核酸等温扩增技术是近年来发展迅速的一种体外核酸扩增技术，与PCR技术不同的是其扩增反应始终在一个温度下进行，无须控温精密的实验仪器和复杂的实验程序，其操作简便、反应快速、检测灵敏度高，在临床和现场快速诊断中显示了良好的应用前景。目前已有的等温技术包括环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）、依赖核酸序列等温扩增（nuclear acid sequence-based amplification,NASBA）、链替代等温扩增、滚环等温扩增、依赖解旋酶等温扩增、单引物等温扩增和核酸快速等温检测放大等。在传染病病原检测方面应用较多的有LAMP、NASBA等。LAMP目前已成功应用于EV71、结核分枝杆菌、登革热病毒、黄热病毒等的检测[26-27]，NASBA已应用于细菌、病毒等多种病原微生物的检测，包括HIV和HCV等[28-29]。LAMP用4条引物识别6个位点，特异性强，但引物设计要求较高，且扩增产物不能用于克隆测序，易形成气溶胶，造成假阳性影响检测结果。NASBA反应成分比较复杂，3种酶的使用增加了反应成本，且不适合DNA类病原检测。

4 生物传感技术

生物传感器是一种由生物感应元件和信号处理元件组成，用于检测各种生物和化学物质的反应系统。生物传感器利用生物感应元件与目标检测物之间相互作用产生响应信号，通过信号处理元件对响应信号进行接收、加工、转换和输出，以此实现对目标物的分析检测[30-31]。近年来，基于功能纳米材料的生物传感器呈现出体积更小、检测速度更快、灵敏度更高和可靠性更好等优异性能，在传染病临床诊断等诸多领域有着十分广阔的应用前景。

表面增强拉曼散射（surface-enhancedRamanscattering,SERS）是一种特殊的表面光学现象，具有选择性强、灵敏度高、特异性好等优点，可从分子水平检测吸附在金属表面的物质并提供物质独特的指纹震动峰，在很多领域都得到实际应用。Wang课题组将一端带有拉曼信号分子的“发卡环”结构DNA分子探针固定在金纳米球微阵列芯片表面，利用分子探针捕获高致病性禽流感H5N1的RNA标识物并发生开环反应，通过SERS的变化来实现RNA的定量检测，可以实现样品RNA的非扩增直接检测[32]。

SERS技术已被广泛应用于病理诊断，使传染病病理不再局限于形态学观察，而是深入到分子水平和遗传水平研究疾病，实现结构-功能的分析。而SERS技术与核酸杂交技术的结合，使分子杂交技术在定量化以及高通量等方面日趋完善。目前生物传感器检测传染性病原体仍处于实验室探索研究阶段，必须注意到它的若干不足，例如:①体积大、现场检测困难；②难以实现高通量和超灵敏度的同时检测；③设备价格贵、使用成本高；④抗干扰能力差、可靠性低；⑤无法实现直接在原始生物样品（如血清、水等）中的检测。这都限制了生物传感器在病原体检测中的应用，因此至今尚无可靠的商业化传感器走向市场。随着现代电子学、微加工技术、生物技术和纳米科学等相关领域的发展，为生物传感器的发展提供了新的机遇和方向。传感器的构建使检测方法将得到进一步改善，可缩短检测时间，提高灵敏度，降低检测限，实现微型化及便携，达到快速、灵敏、方便、成本低等实际检测应用的要求。

5 总结与展望

目前，高通量测序应用于病原体检测的主要问题包括成本高、操作复杂以及后续分析软件不完善，而解决这些问题也是高通量测序在该领域的发展方向。例如，现在测序仪生产商都在大力开发自动化建库设备，甚至准备将其与测序仪整合；而生物信息学专家也在大力开发工业级和医用级软件，相信在不久的将来，高通量测序亦能成为病原体检测的一项主流技术。集样品处理、目标分子扩增、信号检测、结果分析和报告于一体的高集成生物芯片技术和产品的研发是传染病分子诊断用生物芯片领域亟待解决的技术难题，生物芯片技术也正向集成化、微型化、微量化、全自动化、定量化和数据库完善化方向发展。功能纳米材料生物传感器检测目前主要停留在实验室研究阶段，若要用于传染病的现场检测，还须解决抗体等敏感材料容易失活、信噪比较低、检测的重复性和稳定性不高等问题。未来功能纳米材料生物传感器在传染病现场检测中的发展趋势将会集中于研发新型试剂和纳米材料，提高抗体等生物材料的长时间保存活性，并能放大检测信号，降低检测背景，提高信噪比，从而进一步提高检测的灵敏度、准确度及传感器的稳定性。此外，我国传染病分子诊断领域目前还存在以下几个突出问题：第一，缺乏自主创新的分子诊断新技术；第二，已有分子诊断产品的标准化程度不足，缺乏统一标准等原因导致部分产品质量无法保证，影响检测结果的可靠性；第三，特殊病原体分子诊断产品仍然较少，获得注册证书的更少。上述问题的逐步解决，将有力推动我国传染病分子诊断产业的发展。

志谢本文整理和撰写过程中得到倪铭、刘琪琦、陈苏红、肖瑞和汪崇文等的大力支持，在此表示感谢

[1]Rohde H,Qin J,Cui Y,et al.Open-source genomic analysis of Shiga-toxin-producing E.coli O104:H［J］.N Engl JMed,2011, 365(8):718-724.

[2]Kupferschmidt K.Epidemiology.Outbreak detectives embrace the genome era［J］.Science,2011,333(6051):1818-1819.

[3]Palacios G,Druce J,Du L,etal.A new arenavirus in a cluster of fatal transplant-associated diseases［J］.N Engl JMed,2008,358 (10):991-998.

[4]Mason AL,Doucette K,Wong GK.Metagenomics and the case of the deadly hamster［J］.Hepatology,2008,48(2):679-683.

[5]Whitley R.The new age of molecular diagnostics for microbial agents［J］.N Engl JMed,2008,358(10):988-989.

[6]Xu B,Liu L,Huang X,et al.Metagenomic analysis of fever, thrombocytopenia and leukopenia syndrome(FTLS)in Henan Province,China:discovery of a new bunyavirus［J］.PLoSPathog,2011, 7(11):e1002369.

[7]McMullan LK,Folk SM,Kelly AJ,etal.A new phlebovirus associatedwith severe febrile illness in Missouri［J］.NEngl JMed,2012, 367(9):834-841.

[8]Nakamura S,Yang CS,Sakon N,etal.Directmetagenomic detection of viral pathogens in nasal and fecal specimens using an unbiased high-throughput sequencing approach［J］.PLoSOne,2009, 4(1):e4219.

[9]McMullan LK,Frace M,Sammons SA,etal.Using next generation sequencing to identify yellow fever virus in Uganda［J］.Virology, 2012,422(1):1-5.

[10]Yozwiak NL,Skewes-Cox P,Stenglein MD,etal.Virus identification in unknown tropical febrile illness cases using deep sequencing［J］.PLoSNegl Trop Dis,2012,6(2):e1485.

[11]Seth-Smith HM,Harris SR,Skilton RJ,etal.Whole-genome sequences of Chlamydia trachomatis directly from clinical samples without culture［J］.Genome Res,2013,23(5):855-866.

[12]Fodor SP,Read JL,Pirrung MC,et al.Light-directed,spatially addressableparallelchemicalsynthesis［J］.Science,1991,251(4995): 767-773.

[13]Brown H.The real value ofmicroarray technology［J］.LancetOncol, 2003,4(6):326.

[14]Miller MB,Tang YW.Basic concepts ofmicroarrays and potential applications in clinicalmicrobiology［J］.Clin Microbiol Rev,2009, 22(4):611-633.

[15]王升启，彭贤慧，刘琪琦，等.重要呼吸道致病病毒检测基因芯片的制备和用途［P］.中国发明专利.ZL201210015448.1

[16]Zhang W,Huang J,Zhou MF,et al.Protein chip for detection of different HCV antibodies:preparation,quality control,and clinical evaluation［J］.Mol Diagn,2005,9(2):81-87.

[17]Tseng TC,Kao JH.HBV genotype and clinical outcome of chronic hepatitis B:facts and puzzles［J］.Gastroenterology,2008,134(4): 1272-1273.

[18]Chan K,Yam I,Yuen J,etal.A comprehensive HBV array for the detection of HBV mutants and genotype［J］.Clin Biochem,2011, 44(14-15):1253-1260.

[19]Chen LY,Huang J,Zhang XP,et al.Clinical evaluation of oligonucleotide microarrays for the detection of HBV mutants associated with lamivudine resistance［J］.Pharmacogenomics,2005, 6(7):721-730.

[20]Zhang Y,Liu Q,Wang D,et al.Simultaneous detection of oseltamivir-and amantadine-resistant influenza by oligonucleotide microarray visualization［J］.PLoSOne,2013,8(2):e57154.

[21]Zhang Z,Li L,Luo F,et al.Rapid and accurate detection of RMP-and INH-resistant Mycobacterium tuberculosis in spinal tuberculosis specimensby CapitalBioTM DNAmicroarray:a prospective validation study［J］.BMC Infect Dis,2012,12:303.

[22]Qi HJ,Chen SH,Zhang ML,etal.DNA microarrays for visual detection of human pathogenic microorganisms based on tyramine signal amplification coupled with gold label silver stain［J］.Anal Bioanal Chem,2010,398(6):2745-2750.

[23]Hadjinicolaou AV,Farcas GA,Demetriou VL,et al.Development of amolecular-beacon-based multi-allelic real-time RT-PCR assay for the detection of human coronavirus causing severe acute respiratory syndrome(SARS-CoV):a generalmethodology for detecting rapidlymutating viruses［J］.Arch Virol,2011,156(4):671-680.

[24]Kang X,Wu W,Zhang C,et al.Detection of avian influenza A/ H7N9/2013 virus by real-time reverse transcription-polymerase chain reaction［J］.JVirol Methods,2014,206:140-143.

[25]Mackay J,Landt O.Real-time PCR fluorescent chemistries［J］. Methods Mol Biol,2007,353:237-261.

[26]宁永忠.2013年美国《感染性疾病微生物学实验室诊断应用指南》简介—部分病毒综合征［J］.传染病信息，2014，27(1):13-17.

[27]Ou X,LiQ,Xia H,etal.Diagnostic accuracy of the PURE-LAMP test for pulmonary tuberculosis at the county-level laboratory in China［J］.PLoSOne,2014,9(5):e94544.

[28]李敬云.HIV早期感染诊断方法与应用［J］.传染病信息，2007，20 (6):352-356.

[29]Ge Y,Cui L,Qi X,etal.Detection of novel swine origin influenza A virus(H1N1)by real-time nucleic acid sequence-based amplification［J］.JVirol Methods,2010,163(2):495-497.

[30]马莉萍，毛斌，刘斌，等.生物传感器的应用现状与发展趋势［J］.传感器与微系统，2009，28(4):1-4.

[31]Gubala V,Harris LF,Ricco AJ,et al.Point of care diagnostics: status and future［J］.Anal Chem,2012,84(2):487-515.

[32]Pang Y,Wang J,Xiao R,et al.SERSmolecular sentinel for the RNA geneticmarker of PB1-F2 protein in highly pathogenic avian influenza(HPAI)virus［J］.Biosens Bioelectron,2014,61:460-465.

（2014-07-13收稿 2014-08-30修回）

（责任编委 曲 芬 本文编辑 王 姝）

App lication ofmolecular diagnostic techniques to the detection of infectious diseases

WANG Sheng-qi
Institute of Radiation Medicine,Academy of Military Medical Sciences,Key
Laboratory of New Molecular Diagnosis Techniques for Infectious Diseases,Beijing 100850,China

Fast and accurate detection of infectious pathogens is the premise of effective prevention and control of infectious diseases and also the basis for rational use of drugs.However,the traditional diagnostic methods such as isolation and culture of pathogens can not fully meet the needs of clinical therapy of infectious disease and the disease control.The newly developed rapid diagnostic techniques can effectively compensate for the lack of traditional methods.The progress of the application of nextgeneration sequencing,nucleic acid amplification,biochip and biosensor in the infectiousdiseasesdiagnosis is reviewed in thisarticle.

molecular diagnostic techniques;high-throughput nucleotide sequencing;microarray analysis;gene amplification; biosensing techniques;communicable diseases

R349.7

A

1007-8134(2014)05-0266-04

100850，军事医学科学院放射与辐射医学研究所全军暨北京市传染病分子诊断新技术重点实验室（王升启）