慢病毒载体包装与生产方法

蔡晶晶，宋小平，严继贵，王雅洁

（安徽医学高等专科学校药学系，安徽合肥230601）

慢病毒是在人类免疫缺陷I型病毒（HIV－1）基础上发展起来的基因治疗载体，具有携带基因片段容量大、转染效率高、宿主范围广、长期稳定表达等优点，现已经成为转移目的基因的理想载体并用于临床治疗，截止2013年1月已经有62例慢病毒介导的基因治疗临床试验开展。由于1次基因治疗需要1012TU的病毒总量，提高慢病毒的包装与生产水平可有效的促进慢病毒介导的基因治疗的发展［1］。

由于安全性等因素，慢病毒载体逐步改进，现已发展至第三代的四质粒系统，其一般构建流程是将病毒包装必需的3个蛋白Gag／Pol、Rev、VSV－G（代替HIV－1的Env）分别独立放置在3个质粒上，目的基因的载体构建在质粒p Lenti－gene上，然后将四质粒按比例共转染宿主细胞，进行培养后收集上清，纯化病毒。病毒滴度的高低受很多因素的影响，本文就慢病毒质粒提取、病毒包装、细胞培养、病毒纯化等方面对提高慢病毒滴度的研究现状做一综述。

1 慢病毒质粒提取的优化

病毒载体构建的首要环节是慢病毒质粒的提取，质粒的浓度、纯度和构象直接影响后继的转化率及病毒滴度。慢病毒质粒提取试剂盒基本可以达到慢病毒包装的要求，但提取量较少，有研究者将改良后的碱裂解法与中空纤维超滤、分子排阻层析等纯化方法结合用于慢病毒大规模生产，可获得大量浓度高、纯度好的质粒DNA［2］。此外，病毒包装中的衣壳蛋白、逆转录酶和包膜蛋白的增加主要是通过调节包装质粒的比例来实现，不同质粒的比例会很大程度影响质粒转染和慢病毒包装的效率。虽然有关于4个质粒比例的报道，但不同研究结果之间差距较大［2－3］，需要在不同的实验条件下研究确定。

2 慢病毒包装方法

病毒包装主要有瞬时转染与构建稳定包装细胞系2种方法，目前用于基因治疗临床试验的慢病毒主要采用瞬时转染。

2.1 瞬时转染细胞系的选择

为提高病毒滴度，研究人员多选用具有较高的病毒包装能力的293 T细胞，该细胞可表达SV40大T抗原，含有SV40复制起始点的质粒可以复制。293T细胞在相同实验条件下产生的病毒滴度是HEK293细胞的4倍，且293T细胞可以驯化成无血清适应的悬浮细胞，有利于病毒包装的扩大培养［4］。

2.2 瞬时转染方法

常用的瞬时转染方法有磷酸钙转染法、脂质体转染法、聚乙烯亚胺法（PEI）、电穿孔法等。磷酸钙沉淀法安全，价格低廉，大规模生产中应用较多，不足之处是细胞培养需要加入血清来降低磷酸钙对细胞的毒性，且该法受到培养基p H的影响非常大，在实验中对溶液配制及实验操作要求很高［5］；脂质体转染法病毒滴度产量高，所需细胞量只为磷酸钙转染的1／3，但该法价格昂贵，难以用于工业的大规模推广［6－7］；PEI转染法所获的病毒产量比磷酸钙转染法高，且细胞培养中不需更换培养基，转染效率受培养基p H的影响小，但是PEI－质粒复合物对细胞也有一定的毒性，可通过调整PEI含氮量与DNA中磷酸含量的比值（如N／P＝20）来确定PEI的用量，提高转染效率［8－9］；电穿孔法更适合于悬浮细胞的转染，转染后产生的病毒量可达108TU／ml［10］。此外待转染细胞的密度与生长状态也是影响转染效率的重要因素，一般需选择传代次数低，处生长旺盛期，转染时的存活率90%以上，最佳汇合度60%～70%［11］。

2.3 慢病毒稳定包装细胞系的建立

大量研究证实慢病毒可以在稳定细胞系中包装产生，但是基于安全考虑，在慢病毒的大规模生产中尚未使用，多处实验室研究阶段。Stor naiuolo A等［12］针对第三代慢病毒载体构建了同时具有Gag／Pol、Rev、Tat、Rd114－tr等慢病毒元件转录产物的细胞克隆，建立了稳定的包装系以方便产生假型化慢病毒。Broussau S等［13］人建立了稳定的293SF病毒包装细胞系，将VSVG构建在四环素诱导表达系统及cu mate基因开关上，此双重调控避免了包膜蛋白VSVG的过量表达对细胞产生毒性，该细胞系可在无选择压力下产生高滴度病毒长达18周，病毒滴度达8.0×106TU／ml，有望用于基因治疗临床试验的慢病毒生产中。

3 细胞培养方法

3.1 贴壁细胞扩大培养

转染贴壁细胞是目前基因治疗中用慢病毒大规模生产的主要方式，贴壁细胞培养方法主要有细胞工厂、微载体培养等。细胞工厂结构紧密，受污染风险低，常用的细胞工厂有2、4、10层，目前已有报道［4］40层的案例，一批即可收获50L的病毒液。细胞工厂内注入的培养液体积与表层面积之比一般为0.1 ml／cm2～0.16 ml／cm2，此比例有利于产生较高的病毒滴度［14］。同时为提高慢病毒生产过程中的无菌与安全性，有设计将若干收集包管道连接于细胞工厂上，负责提供转染混合物、细胞培养液及收集样品，该系统能降低产品污染的风险，适用于系统、大规模的慢病毒生产［2］。微载体也可实现高密度培养贴壁细胞，但有研究指出该法产生的病毒量要低于细胞瓶培养法［15］。

3.2 悬浮细胞扩大培养

Segura等［16］首次报道了用生物反应器进行慢病毒转染后的悬浮细胞培养，成功的将细胞种子转接到3 L生物反应器中，并在瞬时转染后的3～6d里产量达1.1×106TU／ml；Witting SR等［10］用2 L的Wave摇袋式生物反应器进行慢病毒包装细胞的培养，2d内慢病毒总量达2×1011TU，并可通过调整培养袋的体积来进一步放大培养。此外一些化学物质也会提高慢病毒的产量，如在细胞培养液中加入2～20 m M的丁酸钠或是2～4 m M的咖啡因都会提高慢病毒的产量［9，17］。

4 慢病毒的纯化

实验室用的慢病毒，通常是经过超速离心收获到的病毒粗品，含有的杂质较多，不能用于基因治疗，也不适应慢病毒纯化大规模生产化的要求。要达到人体基因治疗的目的，慢病毒必须去除产品中的蛋白杂质、DNA杂质、内毒素等来确保产物的质量、安全性及有效性。

4.1 离心与膜分离

离心与膜分离技术用于目的产物的初步分离与浓缩，病毒通过超速离心，可使滴度提高102～103倍，但大体积、长时间的离心产生的剪切力可能导致慢病毒颗粒破碎，所以在慢病毒大规模生产中，离心多用于膜分离等病毒原液的浓缩之后［2］。

膜分离技术适合病毒等热敏性物质的分离、浓缩，具高通量、低分辨率的特点。常用的超滤技术可快速进行慢病毒粗液的浓缩，孔径一般选择100～500 k Da，可将病毒原液浓缩20～30倍［18］。该法的主要缺点是滤孔易堵塞，可采用一系列孔径递减的滤膜（如从0.8～0.45μm）来进行过滤以解决这个问题，也可用中空纤维切向流过滤装置来浓缩慢病毒载体，滞留体积低，回收率高，且不易造成阻塞［17］。

4.2 核酸酶消化

慢病毒包装过程中受到质粒DNA及宿主细胞核酸的污染，在所有慢病毒生产中都使用核酸酶来除去核酸杂质，核酸酶消化一般位于慢病毒纯化方案的前期，因核酸酶作为生产过程中引入的杂质，必须在后继的纯化步骤中除去，同时要考虑前期样品体积大加入量多导致的高成本问题。最终的病毒产品要经过检测确保无核酸酶残留［19］。

4.3 层析

层析在生物分子的大规模纯化中应用非常广泛，具有快速、分辨率高、可回收利用的特点。慢病毒在生理p H下呈负电荷，离子交换层析是慢病毒纯化中最有效的层析方法，可高效除去杂蛋白与DNA，同时起到浓缩的作用。有报道用DEAE阴离子交换柱或Mustang Q膜层析纯化可得到约65%的慢病毒收率，且该法适合放大生产［4，20］。

亲和层析中目前能用于慢病毒纯化的配体只有肝素，但该法因成本较高不适合大规模生产，且病毒收率低于离子交换层析，在慢病毒的纯化方法中报道很少。

分子排阻层析一般用于慢病毒纯化后的最后精制，该法仅以分子量为分离依据，温和高效。慢病毒粒子大小约100n m，选择合适的排阻极限可以将大于排阻极限的慢病毒与小分子杂质分离开来，同时除盐、除缓冲液，选择合适的层析介质及孔径大小，可以得到70%～80%的慢病毒收率［20］。

慢病毒纯化几种方法联用时，应选择不同机制的分离单元组成一套分离纯化工艺。整个纯化过程要在低温下进行以保证病毒活性，经过纯化后一般可除去大于99%的杂蛋白与核酸污染，最终得到的病毒滴度一般为108～109TU／ml［14］。

5 展望

慢病毒在临床试验中的应用逐渐增多，基因治疗对慢病毒效价的高要求也促使研究人员要从多方面来研究慢病毒包装产量的提高途径，后续可通过正交设计、统计学分析来优化病毒包装及生产的各个影响因素，以期得到更有效的病毒包装与生产方案，同时提高产物的质量与稳定性。另外构建安全有效的慢病毒稳定包装细胞系与质量控制标准也是今后研究的重点，目前的慢病毒生产仍主要是瞬时转染贴壁细胞，而慢病毒包装细胞系的发展将推动悬浮细胞大规模培养技术的发展，这也将显著提高慢病毒的生产能力。

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