香鱼TGF-β1基因的克隆及其表达与鳗利斯顿氏菌感染的相关性

程 娜， 史雨红， 陈 炯

(宁波大学 应用海洋生物技术教育部重点实验室, 浙江 宁波315211)

转化生长因子(transforming growth factor-β, TGF-β)因其具有“转化”大鼠纤维母细胞的作用而得名，几乎在所有的细胞中表达，主要在T细胞的子集中表达[1]。TGF-β蛋白在结构上进化较保守，具有调节细胞增殖、分化、粘附、形态形成及一些其他生理过程的作用[2]。除了它的生长调节功能，TGF-β还有潜在的免疫调节功能，对免疫系统的细胞成分具有刺激和抑制作用[3]。在免疫系统中TGF-β1是主要的表达产物，在哺乳动物免疫调节中发挥关键作用。在TGF-β1基因敲除小鼠实验中，只有40%的小鼠存活，而60%的小鼠死在子宫内，且存活下来的小鼠在多个组织中出现多病灶炎症性疾病，结合主要组织相容性复合蛋白I类和II类的过度表达及淋巴细胞中免疫球蛋白的分泌过剩，表明TGF-β1基因的敲除引起了小鼠的自身免疫性疾病[4]。Galdiero等[5]用重组TGF-β1蛋白处理鼠伤寒沙门氏菌感染的小鼠，结果表明TGF-β1在免疫应答中的作用可能涉及到复杂的作用机制，在特定胞内微生物的感染中发挥着关键作用，它调节细胞因子产物以及细胞对细胞因子刺激的应答。TGF-β1在免疫应答激活阶段是巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞和白细胞的一个潜在的化学引诱剂[6-7]。另外TGF-β1被认为提供部分或者不完整的免疫球蛋白A(IgA)开关信号，并和白介素-2 (interleukin-2, IL-2)、IL-5一起，通过激活B淋巴细胞来提高IgA的分泌[8-10]。此外，TGF-β有助于提升免疫系统，但在某些情况下，又能抑制免疫系统。它调节粘附分子的表达，为白细胞和参与炎症应答的其它细胞提供一个趋化梯度，然而一旦它们激活后又会抑制这些细胞的趋化[12-13]。

相关研究表明鱼类感染细菌后TGF-β1基因表达变化可能与免疫调节有关。例如，感染鲁氏耶尔森菌(Yersiniaruckeri)的虹鳟，与对照组相比，脾组织中TGF-β1基因mRNA表达变化显著；表明TGF-β1可能参与到鲁氏耶尔森菌引起的鱼类机体适应性应答[14]。Orieux等[15]筛选了自然条件下感染嗜冷黄杆菌(Flavobacteriumpsychrophilum)虹鳟，TGF-β1作为免疫标志基因之一表达量下降，表明病鱼的免疫系统变弱。Harms等[16]研究发现条纹鲈鱼感染分枝杆菌(Mycobacteriummarinum)，9 d后脾单核细胞中TGF-β基因mRNA水平显著低于对照组，表明TGF-β基因mRNA表达下调可能导致炎症反应调节异常，从而引起分枝杆菌敏感性鱼类器官损伤。

香鱼(Plecoglossusaltivelis, sweetfish)属鲑形目、胡瓜亚目、香鱼科、香鱼属，是一种小型经济鱼类。香鱼一直被亚洲人视为“鱼中珍品”。近年来，香鱼的人工养殖规模在逐年扩大。与此同时，香鱼病害问题也在制约着香鱼养殖业的繁荣，鳗利斯顿氏菌(Listonellaanguillarum)是养殖香鱼的主要病原菌之一[17]。另外，大量使用抗生素类，产生增强细菌耐药性、残留危害健康等弊端。因此，进一步研究香鱼免疫相关基因，有助于健康绿色防治香鱼病害，对香鱼养殖业具有重要意义。

本文利用转录组测序的方法，获得了香鱼TGF-β1基因序列，通过多序列比对和系统进化树的构建，对序列和其进化关系进行分析，利用荧光定量PCR检测TGF-β1基因mRNA在各组织的表达量，通过原核表达体系表达TGF-β1成熟肽，并用成熟肽免疫小鼠制备了抗血清。以上研究初步探讨了TGF-β1基因在香鱼侵染细菌急性期的免疫调节作用，有助于进一步研究TGF-β1基因对鱼类的免疫调节作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂

27尾健康香鱼(约20～25 g) ，购自宁海凫溪香鱼养殖场；ICR小鼠，购自宁波大学医学院实验动物中心；Gel Extraction Kit购自Omega公司；1 kb DNA Ladder Marker、RNAiso、ExTaqDNA聚合酶、AMV逆转录酶、pMD19-T Simple Vector、NdeI、XhoI和SYBRPremixExTaq等试剂盒购自Takara公司；SDS-PAGE低分子量标准蛋白，购自上海生物化学与细胞生物学研究所；二抗(辣根酶标记山羊抗小鼠IgG)，购自北京中山金桥生物技术有限公司；显影定影试剂盒、ECL化学发光试剂盒、柯达X-OMAT BT胶片和压片暗盒，购自碧云天生物技术研究所；引物合成及序列测定，由上海英骏生物工程公司完成。鳗利斯顿氏菌菌株ayu-H080701，大肠杆菌TG1、BL21 pLys E和载体pET-28a均来自本实验室。

1.2 香鱼组织样品制备

健康香鱼3尾，用于香鱼组织样品制备，保存于液氮中[18]。其它香鱼随机平均分配，通过显微镜计数鳗利斯顿氏菌，用PBS稀释到1.0×105CFU/mL，腹腔注射实验组(100μL/尾)，对照组注射等量的无菌PBS，并在注射后4、8、16、24 h取样，具体方法见文献[19]。

1.3 香鱼TGF-β1基因序列获得及序列分析

通过转录组测序的方法获得香鱼TGF-β1基因序列，利用在线软件SignalP3.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP/)对TGF-β1基因序列进行信号肽预测，Scanprosite (http://www.expasy.org/tools/scanprosite/和Motifscan(http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan)对其结构特征进行分析，通过软件MEGA4.0完成多重序列比对和系统进化树的构建[20]。

1.4 香鱼TGF-β1基因在健康香鱼各组织中的表达

图1 不同物种TGF-β1基因氨基酸序列的多重比对Fig 1 Multiple alignment of the TGF-β1 amino acid sequences of different species黑色阴影表示氨基酸100%保守区域，“◆”表示TGF-β1成熟肽中，保守的脯氨酸(Pro36)和甘氨酸(Gly46)，“▼”表示9个保守的半胱氨酸残基(组成的典型的“cysteine knot”结构)。各物种登录号分别为：香鱼(JP742920), 虹鳟鱼(CBL93216.1), 斑马鱼(NP_878293.1), 条纹鲈鱼(AAD46997.1), 金头鲷(AAN03842.1), 石斑鱼(ACV96791.1), 大西洋鲑(ACN11294.1), 金娃娃(CAG12751.1), 罗非鱼(XP_003459502.1), 真鲷(XP_003459502.1), 草鱼(ABU84814.1), 人(NP_000651.3), 小鼠(NP_035707.1)。

香鱼各组织RNA的提取和cDNA的合成方法，参考文献[21]。设计TGF-β1基因实时荧光定量(RT-qPCR)检测引物，TGF-β1(+):5′-CTGGAATGCCGAGAACAAAT-3′和TGF-β1(-):5′-GATCCAGAACCTGAGGGACA-3′。内参β-actin扩增引物pActin2(+):5′-TCGTGCGTGACATCAAGGAG-3′和pActin2(-):5′-CGCACTTCATGATGCTGTTG-3′。RT-qPCR检测TGF-β1基因mRNA在健康香鱼各组织中的表达特征，以及感染后在各组织中的表达变化，每个样品做3个重复，具体方法见文献[18]。定量结果采用2-ΔΔCt法进行分析[22]。

1.5 香鱼TGF-β1成熟肽的表达和抗血清制备及Western blot验证

香鱼TGF-β1基因的原核表达引物：TGF(+):5′-CCATATGACCGCAACGGAGACACCT-3′；TGF(-):5′-CCTCGAGCTAGCTACACTTGCA GGACCT-3′(下划线为NdeI和XhoI酶切位点)。 以香鱼肝组织cDNA为模板，PCR扩增香鱼TGF-β1基因的成熟肽，预期大小为336 bp，用2% (w/v)琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，试剂盒回收产物。用NdeI和XhoI酶切回收产物，酶切产物连接到pET-28a载体中，原核表达重组质粒，用18%的SDS-PAGE验证表达的蛋白。切胶纯化后免疫小鼠，3周后取其血清，并通过Western blot实验验证抗血清，具体方法参照文献[20]。

1.6 数据分析

采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，对实时荧光定量结果进行数据分析，P<0.05为显著差异。

2 结果

2.1 香鱼TGF-β1基因序列分析

香鱼TGF-β1基因完整的开放阅读框，由1134个核苷酸组成，编码377个氨基酸、分子量为43 kDa的前体蛋白。前体蛋白N端前19个氨基酸为信号肽序列，在线软件NetNGlyc1.0 Server预测前体蛋白中存在4个潜在的糖基化位点，分别在73、111、122、254氨基酸位点，等电点为8.72。成熟肽由C末端112个氨基酸组成，分子量大小为12.5 kDa。多重序列比对发现，鱼类和哺乳类TGF-β1的氨基酸序列具有较高的保守性，特别是C末端的成熟肽区域(图1)。前体蛋白含有一个KEX-Furin样蛋白酶识别位点(RKRR)和一个整合素结合位点(RGD)，相关研究表明，KEX-Furin样蛋白酶，可以在RKRR位点把前体蛋白切割为前导肽和成熟肽；RGD位点能够特异性结合整合素，例如有报道表明RGD位点与αvβ6特异结合，从而活化TGF-β1[23]。成熟肽中含有一个典型的“cysteine knot”结构，由9个半胱氨酸组成。其中的8个半胱氨酸形成4对链内二硫键，并和第9个半胱氨酸结合，形成链间二硫键，从而构成TGF-β1二聚体[24]。另外，成熟肽中还含有一个保守的脯氨酸(Pro36)和一个保守的甘氨酸(Gly46)以及一个“CXC”结构，这些保守的位点被认为是TGF-β家族分子的共同特征[25]。

通过氨基酸多序列比对，揭示香鱼TGF-β1成熟肽与虹鳟的同一性最高为93%；与其它已知鱼类TGF-β1成熟肽的同一性在73%以上；与哺乳动物TGF-β1成熟肽的同一性在62%～70%之间。通过分析系统进化树的结果，揭示香鱼TGF-β1基因与虹鳟的进化关系最近，和哺乳动物TGF-β1基因分别成簇(图2)。

2.2 香鱼TGF-β1基因组织表达特征

RT-qPCR检测香鱼TGF-β1基因mRNA在各组织中的表达量。以香鱼TGF-β1在肝组织中的表达量为对照，其他各组织的相对表达量如下图所示：在免疫相关的肾组织中表达量最高，肝、脾组织中表达量次之(图3)。

图2 香鱼和其他物种TGF-β1氨基酸序列的系统进化树

图3 TGF-β1基因mRNA在香鱼各组织中的表达

2.3 感染后香鱼各组织TGF-β1基因mRNA的表达变化

香鱼感染鳗利斯顿氏菌后，各组织中的TGF-β1基因mRNA表达量均发生了变化，表达水平都有一个显著上调的过程。各组织中表达变化量又有所不同，其中肾组织中TGF-β1表达量变化最为显著，注射12 h时为对照组的14.5倍，其次是脑组织的表达变化，8 h的表达量为对照组的6倍。脾、心脏和鳃分别为3.3、3.7和3.5倍，其余组织表达量变化均在3倍以下(图4)。

2.4 香鱼TGF-β1的原核表达和抗血清制备

原核表达质粒pET-28a-TGF-β1经测序验证无误后，转化大肠杆菌BL21 pLys E，经IPTG诱导表达后，18%的SDS-PAGE电泳检测，结果显示蛋白分子量大小约为14.5 kDa(图5)，符合预期大小(12.5 kDa TGF-β1成熟肽+2.0 kDa His-tag)。用目的蛋白免疫小鼠，3周后取小鼠血清。Western blot验证上述抗血清，所得抗血清能与目的蛋白TGF-β1起特异性反应，但不与细菌蛋白自身反应，可用于后续相关研究。

图4 实时荧光定量PCR检测香鱼各个组织TGF-β1基因mRNA表达变化

n= 3；* :P< 0.05

图5 香鱼TGF-β1成熟肽原核表达和抗血清验证

A:TGF-β1基因原核表达的SDS-PAGE电泳图。M: 标准蛋白质(kDa); 1: 转有pET-28a(+)空载的BL21 plys E菌体蛋白; 2: 转有pET-28a-TGF-β1重组质粒的BL21 plys E菌体蛋白; 3: TGF-β1蛋白切胶纯化产物; B: Western blot验证TGF-β1抗血清特异性, ECL显影。1: 转有pET-28a(+)空载的BL21 plys E菌体蛋白; 2: 转有pET-28a-TGF-β1重组质粒的BL21 plys E菌体蛋白。

3 讨论

本研究通过转录组测序，获得了香鱼TGF-β1的基因序列。序列分析表明，TGF-β1前导肽序列中前19个氨基酸残基为信号肽，成熟肽由C末端112个氨基酸组成了，分子量大小为12.5kDa。多序列比对表明香鱼TGF-β1成熟肽与虹鳟鱼同源性最高为93%，系统进化树分析表明与虹鳟的进化关系最近，和哺乳动物TGF-β1分别成簇。

RT-qPCR检测TGF-β1基因在健康香鱼各组织中的表达情况，结果表明在心、肝、脾、肾、脑、肌、肠、鳃8个组织中均有表达。在免疫相关的肾组织中表达量最高，肝、脾组织中表达量次之。已报道的TGF-β1基因几乎在所有的组织和细胞中表达。如鲤鱼在鱼卵，头肾、肝、脾、皮肤，头肾白细胞中均有表达，在头肾白细胞、头肾、脾中表达量较高[26]；虹鳟在肝、脾、头肾、肾、心、脑、鳃、肌肉、肠等14个组织中均有表达，在头肾、脾、肾组织中表达量较高[27]；金鱼的TGF-β1基因在头肾、肾、肝、脾、脑、心、鳃、肠中均有表达，在皮肤、肾、脾中表达量较高[28]；草鱼在脾、鳃、脑、肝、肌肉、肾、头肾巨噬细胞和外周血白细胞中均有表达，在头肾巨噬细胞、鳃中表达量较高[29]。

本研究通过人工腹腔注射香鱼，使其感染鳗利斯顿氏菌，RT-qPCR检测各组织24 h内TGF-β1基因mRNA的表达变化，各组织的表达量均发生了变化。其中肾组织中TGF-β1基因mRNA表达量变化最为显著，注射12 h时为对照组的14.5倍，表明TGF-β1基因的mRNA表达变化与香鱼感染鳗利斯顿氏菌的急性期过程相关。鳗利斯顿氏菌可以侵染大多数海水鱼，对海水养殖鱼类危害大，也是被研究较多的弧菌[30]。Caipang等[31]用鳗利斯顿氏菌人工感染大西洋鳕鱼(Gadusmorhua)，研究发现感染后血清中载脂蛋白A-I、非特异性细胞毒素细胞受体蛋白1、白介素1等相关免疫基因均出现显著变化。Tierney等[32]通过人工感染鳗利斯顿氏菌虹鳟，观察虹鳟在水中游泳表现，感染低浓度的和对照组无明显变化，高浓度组出现明显异常。Rojo等[33]通过腹腔注射鳗利斯顿氏菌人工感染斑马鱼，研究显示白介素1β、Toll样受体22、肿瘤坏死因子等免疫相关因子在感染后表达显著变化。目前尚未见有关于细菌感染香鱼后TGF-β1基因或蛋白表达变化的文献。本文通过鳗利斯顿氏菌人工感染香鱼，并测定TGF-β1的表达变化，表明TGF-β1的表达变化与香鱼感染鳗利斯顿氏菌的急性期过程相关，可能参与到鱼类免疫调节过程中。另外，TGF-β1基因在鱼类免疫调节中具体的作用机制尚未明确，还有待进一步研究。

本研究揭示TGF-β1可能在香鱼感染鳗利斯顿氏菌急性期的免疫应答过程中发挥作用，有助于下一步研究TGF-β1基因对鱼类的免疫调节作用机制。

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