过表达和沉默Gg4对小鼠胸腺上皮细胞迁移的影响

宋 波， 郭 佳， 袁华平， 关 锋

(1. 江南大学 生物工程学院 糖化学与生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122 2. 江苏省昆山市疾病预防控制中心，江苏 昆山 215301)

糖生物学研究已成为21世纪生命科学的前沿和热点领域之一，而糖鞘脂的结构和功能是糖生物学研究的主要内容。糖鞘脂广泛分布于脑组织神经细胞的膜表面，具有促进神经再生、轴突生长、突触形成以及恢复神经支配等功能[1]，是细胞膜表面脂筏的重要组成部分，对脂筏的形成和稳固有着重要作用，并能促使胆固醇在脂筏中偏向胞质一侧分布[2]。糖鞘脂还参与了细胞生长、增殖、分化、凋亡、黏附及信号转导等过程[3-6](图1)。最新研究[7]发现某些糖鞘脂参与了细胞癌变的重要过程——上皮间质转化(胚胎发育和恶性肿瘤发展的一个重要过程，细胞由正常的上皮细胞转变为间质细胞，迁移能力和侵袭能力得到显著增强)。

糖鞘脂四糖基脑酰胺Gg4是由糖链、长链脂肪酸和鞘氨醇(Sphingosine)的长链碱基3部分组成的两性分子，主要富集于细胞膜上不溶于Triton X-100的区域，在可溶于Triton X-100的膜组分中，Gg4也有表达，但表达量极少[8]。本课题组前期工作中用转化生长因子TGF-β处理NMuMG细胞使之发生EMT过程，发现Gg4显著下调，而在细胞培养液中添加Gg4可以显著抑制NMuMG细胞发生EMT，免疫共沉淀实验也证明Gg4与E-钙黏蛋白和β-连锁蛋白存在相互作用，从而提出Gg4可以巩固E-钙黏蛋白/β-连锁蛋白复合体的模型[9-12]。

图1 糖鞘脂的结构及生物学功能(Sen-itiroh Hakomori, PNAS, 2002)

本文以NMuMG细胞为研究对象，运用基因工程技术将鼠源β3GalT4基因的全长序列和沉默β3GalT4表达的shRNA分别克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)和pSUPER-retro中，稳定转染NMuMG，构建β3GalT4过表达和β3GalT4沉默NMuMG细胞株，通过薄层层析和免疫印迹验证了在两个稳定转染细胞株中Gg4表达分别上调和下调，细胞迁移实验发现两株细胞的迁移能力分别降低和增强，证实Gg4在细胞迁移方面具有重要的生物学功能。

1 材料和方法

1.1 材料

大肠杆菌 JM109、真核表达载体pcDNA3.1(+)和pSUPER-retro由本实验室保存；小鼠胸腺上皮细胞NMuMG来自于美国模式培养物集存库ATCC。

细胞RNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒和Ultra SYBR Mixture Real-Time试剂盒购于北京康为世纪生物科技有限公司；Rever Tra Ace-α-逆转录试剂盒和DNA 高效Ligase购于TOYOBO公司；限制性内切酶、DNA Ladder marker、DNA切胶回收试剂盒和纯化试剂盒购于Takara公司；DNA聚合酶购于天根生化科技有限公司；DMEM培养基、胎牛血清和青霉素/链霉素溶液购于Life technologies公司；LipofectamineTM2000转染试剂购于Invitrogen公司；抗生素、胰岛素和氯金酸购于Sigma公司；糖脂标准品购于MATREYA公司；TKH7由美国Biomembrane研究所S. Hakomori教授惠赠；Westar Nova 2011显色液购于CYANAGEN公司；Goat anti-Mouse IgM-HRP购于Southern Biotech公司；HPTLC Silica gel 60 F254薄层层析板购于EMD Chemicals公司；DISCOVERY DPA-6S柱购于SUPELCO公司；MTT试剂购于烟台赛尔斯生物技术有限公司；引物合成及测序由上海英潍捷基贸易有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1β3GalT4过表达和沉默真核表达载体的构建

通过PCR扩增鼠源β3GalT4基因CDS区(引物见表1)，克隆至pcDNA3.1(+)；根据RNA干扰原则在β3GalT4基因CDS区内设计合成3段靶序列(引物见表1)，克隆至pSUPER-retro，分别转化JM109感受态细胞，筛选阳性转化子进行菌落PCR(引物见表1)，并提取质粒后单、双酶切验证，阳性克隆经上海英潍捷基公司测序鉴定得到进一步确认。获得正确的重组质粒，分别命名为pcDNA3.1(+)/β3GalT4和pSUPER-retro/β3GalT4 shRNA1, 2和3号。

表1 实验中的相关引物

1.2.2 细胞培养、转染及β3GalT4过表达和沉默细胞株的筛选

NMuMG细胞在含10%(v/v)胎牛血清、10 μg/mL胰岛素、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM培养基、37℃下含5%(v/v)CO2的细胞培养箱中培养。参照LipofectamineTM2000说明书，将重组质粒pcDNA3.1(+)/β3GalT4和pSUPER-retro/β3GalT4 shRNA 1, 2, 3号转染NMuMG细胞，培养24 h后分别加入终浓度600 μg/mL G418和4 μg/mL Puro筛选2周。挑取单细胞克隆扩大培养，Real-Time PCR及半定量PCR(引物见表1)筛选β3GalT4过表达和沉默的NMuMG单克隆细胞株。

1.2.3 糖鞘脂的提取

按文献[13]方法提取细胞糖鞘脂。提取后，将提取物上样DISCOVERY DPA-6S柱，用10倍柱床体积的ddH2O对样品进行脱盐处理后，加入2 mL氯仿/甲醇(v/v=2/1)洗脱并收集，提取物在氮气下吹干后加入200 μL氯仿/甲醇(v/v=2/1)复溶，用于后续实验。

1.2.4 薄层层析和免疫印迹分析糖鞘脂的表达差异

按文献[14]方法薄层层析分析糖鞘脂的表达。每一样品在硅胶板上对称点样2次，展层后切割硅胶板，一半用于地衣酚显色，另一半用于免疫印迹实验。Gg4免疫印迹：切割后，将硅胶板浸泡于1% BSA/PBS(w/v)中，室温震荡封闭30 min，加入Gg4抗体TKH7(TKH7∶1% BSA/PBS=1∶5, v/v)，室温震荡孵育2 h后TBS-T清洗3次，每次5 min。加入HRP标记的IgM(IgM∶1% BSA/PBS=1∶5000, v/v)，室温震荡1 h后TBS-T清洗3次，每次5 min。将底物试剂A和B等体积混合制备显色液淋洗硅胶板，暗室曝光拍照。

1.2.5 胶体金及MTT实验

胶体金实验：六孔板每孔加入2 mL过滤的1% BSA(w/v)，室温孵育3 h后吸出BSA，无水乙醇清洗1次，室温干燥1 h。按文献[15]方法配制胶体金悬液。六孔板每孔加入2 mL胶体金悬液，室温沉淀40 min后弃上清，用无血清培养基清洗1次，加入2 mL细胞悬浊液(每孔约1500个细胞)，37℃培养18 h，拍照分析细胞迁移。

MTT实验：24孔板每孔接2×104个细胞，37℃分别培养20 h、40 h和60 h后加入20 μL MTT试剂，37℃孵育4 h，弃上清，每孔加入700 μL DMSO，混匀后，取200 μL至96孔板中，测OD595分析细胞增殖。

2 结果与分析

2.1 pcDNA3.1(+)/β3GalT4表达载体的构建及验证

依照实验方法筛选转化子提取质粒后进行EcoR I、XhoI双酶切和EcoR I单酶切验证。双酶切后2个片段分别为1.1 kb和5.4 kb(泳道2)，单酶切后片段大小为6.5 kb(泳道3)，符合实验设计的预期大小。基因测序结果也与Genebank中鼠源β3GalT4序列完全一致，表明pcDNA3.1(+)/β3GalT4表达载体构建成功(图2)。

图2 重组表达载体pcDNA3.1(+)/β3GalT4的酶切验证

1—DL2000 DNA Marker；2—重组质粒双酶切；3—重组质粒单酶切；4—1 kb DNA Marker。

2.2 pSUPER-retro/β3GalT4 shRNA1, 2和3号表达载体的构建及验证

以pSUPER-retro/β3GalT4 shRNA1号为例。筛选转化子菌落PCR、EcoR I和XhoI双酶切及BglⅡ单酶切验证。pSUPER-retro和转化子菌落PCR扩增片段分别为240 bp(泳道2)和300 bp(泳道3)，双酶切片段大小分别为238 bp(泳道4)和298 bp(泳道5)；pSUPER-retro单酶切后被切开(泳道6)，转化子由于插入shRNA序列致使BglⅡ酶切位点发生改变而不能被切开(泳道7)，结果与预期的实验设计相符。基因测序证实pSUPER-retro/β3GalT4 shRNA1号表达载体构建成功(图3)。

图3 重组表达载体pSUPER-retro/β3GalT4 shRNA1号菌落PCR及酶切验证

1—50 bp DNA Marker；2—pSUPER-retro PCR；3—转化重组质粒的JM109菌落PCR；4—pSUPER-retroEcoR I和XhoI双酶切；5—重组质粒EcoR I和XhoI双酶切；6—pSUPER-retroBglⅡ单酶切；7—重组质粒BglⅡ单酶切；8—1 kb DNA Marker。

2.3 β3GalT4过表达NMuMG细胞株的筛选

通过Real-Time PCR筛选β3GalT4过表达NMuMG细胞株。对比转染空质粒的NMuMG细胞，编号2-7-2和2-7-5细胞株的2-△△CT值分别为7.12和8.42，P-value均为0.001(图4A)，表明2株细胞中β3GalT4显著上调。2-7-5细胞株半定量PCR验证：以tubulin作对照(泳道4和5)，2-7-5细胞株(泳道3)β3GalT4表达水平显著高于转染空质粒NMuMG细胞株(泳道2)图4B。结果表明：筛选到的2-7-5细胞株为β3GalT4过表达NMuMG细胞株。

图4 Real-Time PCR和半定量PCR筛选β3GalT4过表达细胞株

A—编号2-7-2和2-7-5细胞株Real-time PCR； B—编号2-7-5细胞株半定量PCR。1—DL2000 DNA Marker；2—转染空质粒NMuMG细胞β3GalT4 PCR；3—编号2-7-5细胞株β3GalT4 PCR；4—转染空质粒NMuMG细胞tubulinPCR；5—编号2-7-5细胞株tubulinPCR。

2.4 β3GalT4沉默NMuMG细胞株的筛选

通过Real-Time PCR筛选β3GalT4沉默NMuMG细胞株：对比转染空质粒的NMuMG细胞，编号1-1和2-3细胞株的2-△△CT值分别为0.575和0.950，P-value分别为0.0002和0.063(图5A)，表明1-1号细胞株β3GalT4表达下调。1-1细胞株半定量PCR验证：以tubulin作对照(泳道4和5)，1-1细胞株(泳道3)β3GalT4表达水平低于转染空质粒NMuMG细胞株(泳道2)(图5B)。结果表明：筛选到的1-1细胞株为β3GalT4沉默NMuMG细胞株。

图5 Real-Time PCR和半定量PCR筛选β3GalT4沉默细胞株

A—编号1-1和2-3号细胞株Real-time PCR；B—编号1-1号细胞株半定量PCR。1—DL2000 DNA Marker；2—转染空质粒NMuMG细胞β3GalT4 PCR；3—1-1细胞株β3GalT4 PCR；4—转染空质粒NMuMG细胞tubulinPCR；5—1-1细胞株tubulinPCR。

2.5 β3GalT4过表达和沉默细胞株Gg4的表达

标品5 μL、样品30 μL点样于硅胶板上。薄层层析实验表明NMuMG细胞过表达β3GalT4 后Gg4表达上调(图6A)，沉默β3GalT4后Gg4表达下调(图6B)；免疫印迹实验证实NMuMG细胞过表达β3GalT4后 Gg4显著上调(图6C)，沉默β3GalT4后细胞株Gg4表达下调(图6D)。实验结果证实：过表达和沉默NMuMG细胞β3GalT4后 Gg4分别显著上调和下调。

图6 β3GalT4过表达、沉默和NMuMG细胞株Gg4薄层层析及免疫印迹

A)β3GalT4过表达和NMuMG细胞株糖鞘脂薄层层析；B)β3GalT4沉默和NMuMG细胞株糖鞘脂薄层层析；C)β3GalT4过表达细胞株的Gg4免疫印迹；D)β3GalT4沉默细胞株的Gg4免疫印迹。

2.6 过表达和沉默Gg4对NMuMG细胞形态、细胞迁移和细胞增殖的影响

图7 过表达和沉默Gg4对NMuMG细胞水平的影响

A—细胞照相(×100倍)； A上—细胞形态； A下—细胞迁移；B— 细胞迁移；C—细胞增殖。

对Gg4过表达、沉默及NMuMG细胞株培养24 h显微照相观察。转染株细胞形态与NMuMG相比无明显变化(图7A)。胶体金检测细胞迁移表明：过表达Gg4后，NMuMG细胞迁移能力明显降低；沉默Gg4后，NMuMG细胞迁移能力略有增加(图7A、B)。将3种细胞株以相同接种量分别培养20 h、40 h和60 h，通过MTT实验检测细胞增殖情况，结果表明过表达和沉默Gg4对NMuMG细胞增殖都没有显著影响(图7C)。

3 讨论

对糖鞘脂Gg4的研究报道并不多，这可能与Gg4在细胞中定位和表达量有关。已有报道证明Gg4分布于Hela细胞和小鼠自然杀伤细胞膜表面的脂筏区域，当巨噬细胞和T细胞被激活后，自然杀伤细胞中的Gg4表达显著增高[16]。Feldman等人发现绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)的鞭毛蛋白可以结合宿主细胞膜上的Gg4，从而逃逸宿主细胞反应[17]。Gg4和Toll样受体5(Toll-like receptor 5)互相作用，介导钙离子的瞬间流入和ATP从细胞内的释放，而流入的钙离子导致了胞外信号调节激酶(Extracellular signal-regulated kinase, ERK)信号通路的激活[18]。

本研究利用基因工程技术将β3GalT4在NMuMG细胞中过表达及沉默，构建了β3GalT4过表达和沉默NMuMG永久转染细胞株。在β3GalT4过表达转染株中，Gg4的表达显著增加，细胞迁移能力降低，而在β3GalT4沉默的细胞株中，Gg4的表达下降，细胞迁移能力升高(图6和7)，证实了Gg4具有抑制细胞迁移的生物学功能。结合课题组前期的研究结果，Gg4可以巩固E-钙黏蛋白和β-连锁蛋白的相互作用，增加细胞粘附，这也可能是Gg4抑制细胞迁移的原因。此外，实验中运用基因沉默技术抑制β3GalT4基因的表达，效率约50%，若采用基因敲除技术彻底抑制Gg4的表达，可深入研究Gg4与其他蛋白或者受体相互作用、Gg4在膜上的定位以及对相关信号通路的影响。

总之，本实验结果证实Gg4在抑制细胞迁移方面具有重要作用，鉴于细胞粘附和迁移对癌症发生发展尤其是EMT过程具有重要意义，因此，本研究为Gg4在EMT过程中功能的行使提供了力证。另外，实验构建的Gg4过表达和沉默永久转染NMuMG细胞株可为研究Gg4巩固E-钙黏蛋白/β-连锁蛋白复合体的分子机制提供良好的细胞模型，也可为进一步探索其新的功能做出贡献。

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