壮筋续骨汤对骨折大鼠血清GH与IGF-1水平和骨折愈合影响

张淑玲，周缜，宁驰，祝汉忠，邹晓

(1 青岛市(中心)肿瘤医院，山东 青岛 266042； 2 青岛大学医学院中西医结合中心)

骨组织形成过程中，激素调节与生长因子调节、神经系统调节共同形成了神经-内分泌-局部生长因子调节网络，参与骨组织形成的整个过程[1]。生长激素(GH)是由垂体分泌的多肽，是胶原生长的一种主要调节剂[2]。下丘脑GH-胰岛素样生长因子-1(GH-IGF-1)系统是一个重要的调节人体代谢的内分泌轴，不仅对人体的生长发育起着重要的调控作用，对成年后人体组织的修复重建亦有一定的调控作用[3]。研究结果表明，任何对下丘脑GH-IGF-1系统产生影响的因素均可影响人体的生长发育与修复重建过程[4]。动物实验和临床研究证实，壮筋续骨汤能够促进骨折愈合[5-6]，但其机制尚不十分明确。本实验试图观察壮筋续骨汤对大鼠股骨骨折后血清GH和IGF-1水平影响，探讨其促进骨折愈合的作用机制。现将结果报告如下。

1 材料和方法

1.1 动物分组

成年健康雄性Wistar大鼠72只，清洁级，体质量230～250 g，由青岛市药物检验所动物中心提供，合格证号：SCXK(鲁)20120010。将动物适应性饲养7 d后，用随机数字表法分为对照组、模型组和治疗组各24只。

1.2 模型制备

各组均应用100 g/L水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉动物，俯卧位固定，常规消毒，无菌操作，行外侧切口，经股前、外侧肌间隔分离至股骨。模型组和治疗组大鼠用低速牙科钻在股骨中段切断股骨，然后行克氏针(直径1 mm，上海医用缝合针厂)髓腔逆行固定，逐层缝合，无菌包扎，手术成功率100%[7]。对照组不切断股骨，其余步骤同上。动物术后常规笼养，自由活动与进食。

1.3 治疗方法

根据清代赵濂《伤科大成》配方，由青岛大学附属医院制剂室依据《医疗机构中药煎药室管理规范》(国中医药发[2009]3号)制备壮筋续骨汤。每副中药充分煎煮两次，得药液224 mL，内含生药112 g，浓度5.0 g/L。根据王祥杰等[8]报道的剂量1.25 g/kg (2.5 mL/kg)，治疗组每日灌胃1次，连续28 d。对照组和模型组同步给予等量的生理盐水。

1.4 评价指标和方法

1.4.1大体观察 治疗后7、14、21、28 d，每组各取6只动物，水合氯醛麻醉，完整取出股骨，剔除多余软组织，生理盐水洗涤，观察记录骨折愈合情况。然后置于40 g/L的多聚甲醛溶液中固定24 h，蒸馏水浸泡4 h，再置于200 g/L乙二胺四乙酸溶液中脱钙15 d。常规乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，沿股骨纵轴连续切片，厚度5 μm，贴于载玻片上。苏木精-伊红染色，观察骨痂组织结构。

1.4.2酶联免疫吸附试验(ELISA)检测 各组实验结束后，大鼠禁食12 h，然后以100 g/L的水合氯醛溶液(300 mg/kg)进行腹腔注射麻醉，经腹主动脉取血4 mL，4 000 r/min离心10 min，分离血清，采用双抗夹心ELISA试剂盒(BG公司)测定血清GH和IGF-1水平。测定前室温复融，再次离心取上清液标本100 μL，用酶标仪(Bio-Rad 550型，美国)在450 nm波长处测定GH和IGF-1的吸光度值，根据样品的吸光度值在坐标上找出对应的GH和IGF-1的浓度，单位以“ng/L”表示。

1.5 统计学处理

2 结 果

2.1 大体解剖观察

对照组大鼠骨皮质完整，模型组骨折7 d骨折断端主要为纤维性肉芽组织，至14 d形成纤维性骨痂，21 d纤维性骨痂增多并出现软骨骨痂，28 d形成软骨-骨性骨痂。治疗组大鼠术后7～21 d骨痂结构与模型组相应时间点比较无明显差异，但至术后28 d骨痂硬度较模型组明显增大。

2.2 组织病理观察

对照组大鼠骨质结构正常。模型组大鼠术后骨折端断为血肿组织所填充，骨折后7 d形成肉芽组织，14 d骨折端形成大量纤维性骨痂，21 d有散在骨小梁形成，28 d骨小梁清晰可见。治疗组骨痂结构在7～21 d与模型组相应时间比较无显著性差异，但至28 d显著优于骨折组。

2.3 血清GH水平

大鼠血清GH水平在对照组术后7～28 d未见显著性变化(F=3.18，q=0.46～1.76，P>0.05)，在模型组和治疗组术后的7～21 d也未见显著性变化(F=2.73，q=0.32～2.11，P>0.05)，但28 d较21 d显著下降(t=10.46，P<0.05)。组间比较表明，大鼠血清GH水平在模型组和治疗组术后7～28 d各时间点均显著高于对照组(F=13.64，q=2.15～12.31，P<0.05)；治疗组术后7～21 d与模型组相应时间点比较差异无显著意义(F=1.16，q=0.24～1.78，P>0.05)，但28 d仍显著高于模型组(t=6.48，P<0.05)和对照组(t=12.82，P<0.05)。见表1。

表1 各组治疗后血清GH水平

2.4 血清IGF-1水平

大鼠血清IGF-1水平在对照组术后7～28 d未见显著性变化(F=1.31，q=0.17～2.06，P>0.05)，模型组和治疗组术后7～21 d无显著性变化(F=2.15，q=0.62～1.83，P>0.05)，至28 d较21 d则显著下降(t=6.11，P<0.05)。组间比较则表明，大鼠血清IGF-1水平在模型组和治疗组术后7～28 d各时间点均显著高于对照组(F=21.42，q=3.01～16.19，P<0.05)；治疗组术后7～21 d与模型组相应时间点比较差异无显著意义(F=1.92，q=0.49～

1.34，P>0.05)，但28 d则显著高于模型组(t=5.94，P<0.05)和对照组(t=7.51，P<0.05)。见表2。

表2 各组治疗后血清IGF-1水平

3 讨 论

骨的更新或再建包括破骨细胞吸收骨和成骨细胞生成骨两个过程，即骨骼不断摄取血浆中的钙以供骨的生长，同时骨骼又不断地被吸收，将骨钙释放入血。骨折后某些骨生长因子能促进新骨形成，缩短骨折愈合时间[9]。动物实验研究表明，外源性生长激素对骨折愈合有促进作用，且愈合时间平均提前1周[10]。但是外源性细胞因子半衰期短， 被清除率高，非注射给药生物利用度低，不能持续有效地促进骨折愈合，使其临床应用范围受到限制。研究表明，中药有效成分可促进生长激素的分泌[11]，而生长激素是调节物质代谢的主要激素，它把成骨活动中钙磷代谢协调起来共同调节成骨作用，促进成骨细胞的有丝分裂，加速成骨细胞分化。GH对骨的主要作用机制如下。①刺激成纤维细胞IGF-Ⅰ及IGF-Ⅱ的形成。其中IGF-Ⅰ又被称为骨生长因子，具有促进骨细胞的有丝分裂，抑制破骨细胞的形成与成熟，诱导破骨细胞加速凋亡等作用[12]，从而促进骨折愈合。②促进软骨生长板细胞分化和生长。③改善肠钙吸收，兴奋肾脏羟化酶活性，促进骨盐形成[13]。④促进硫酸软骨素和胶原合成，加速软骨的钙化进程[14]，有效增加皮质骨量，改善骨的整体力学性能[15]。骨折后垂体嗜酸性细胞GH表达增强，血清GH水平在24 h内显著升高，从而影响成骨细胞分化，促进骨钙素合成，促进糖异生、抑制糖降解，进而提高血糖水平以代偿创伤对人体造成的急性损坏[16]。此外，IGF-1可诱导成骨细胞合成胶原Ⅰ，有利于成骨细胞改样沉积和骨小梁的形成，有利于骨折的愈合和骨的改建和重塑。

中药治疗骨折除解痉止痛、活血化瘀、去腐生肌等常规作用外，是否也直接或间接影响骨生长因子的分泌、降解和活性调节，目前尚无完整的理论支持。壮筋续骨汤出自清代赵濂编纂的《伤科大成》。其中，当归、川芎合用祛瘀行滞活血，熟地益精填髓，

黄芪补气益气，三七具散瘀止血、消肿止痛，续断补肝肾壮骨，杜仲补肝肾强筋骨，骨碎补肾强骨，红花活血通经，去瘀止痛；白芍补血止痛。从壮筋续骨汤的组方综合分析，有活血化瘀、接骨续筋等功效，符合 “瘀去、新生、骨合” 的中医治则。本实验结果显示，壮筋续骨汤在骨折术后第1～3周内并没有提高大鼠血清GH和IGF-1的水平，只是在21 d后继续维持血清GH和IGF-1较高水平，说明壮筋续骨汤不是通过促进GH和IGF-1分泌，而只是起到减缓其降解速率、增强其活性，从而促进骨折愈合。

影响骨折愈合的因素较多，壮筋续骨汤的有效成分又极为复杂，本实验仅检测了GH和IGF-1两项指标，难以全面反映壮筋续骨汤的疗效和机制。今后需要提取壮筋续骨汤的有效成分，从细胞因子、有关激素、胶原合成、钙磷代谢等方面深入研究。

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