TUBB3基因对NSCLC病人术后辅助化疗预后评价

郑志强，唐怀好，张文峰，王勇杰

(1 青岛大学医学院附属青岛市海慈医疗集团胸外科，山东 青岛 266033； 2 青岛大学医学院附属医院胸外科)

目前，临床上对于Ⅱ～ⅢA期的非小细胞肺癌(NSCLC)病人，在根治性切除术后接受铂类联合第三代抗肿瘤新药的辅助化疗已成为标准治疗模式。但是，NSCLC完全切除术后辅助化疗的疗效欠佳，其术后5年生存率及无疾病生存率分别仅提高了4.1%和5.1%，主要是由于化疗药物的毒副作用及耐药性所致。因此，研究耐药性产生的分子机制，对提高化疗疗效和生存期具有重要意义。已有研究结果表明，3型β微管蛋白(TUBB3)与抗微管化疗药物关系最为密切。但是，目前TUBB3表达水平与NSCLC病人术后辅助化疗疗效的关系尚无定论，国内外研究结论不一[1]。为此，我们研究了88例行长春瑞滨+顺铂(NP)方案辅助化疗的NSCLC病人术后标本，检测肿瘤组织中TUBB3 mRNA表达水平，分析其与NSCLC病人临床特征及预后的关系，为NSCLC病人个体化治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

2006年1月—2009年12月，于我院接受根治性手术治疗的Ⅱ～ⅢA期NSCLC病人88例，所有病人临床病理和随访资料完整。其中男57例，女31例；年龄≤65岁47例，>65岁41例，中位年龄62岁；鳞状细胞癌48例，腺癌36例，其他4例(腺鳞癌3例，大细胞癌1例)；高分化26例，中分化33例，低分化29例；按2009年国际抗癌联盟TNM分期标准，ⅡA期24例，ⅡB期31例，ⅢA期33例。本组病人治疗期间无死亡及严重并发症，术前未行放化疗，术后均行NP方案辅助化疗4周期。本研究经医院伦理委员会批准，病人及家属均签订知情同意书。

1.2 主要仪器与试剂

石蜡RNA提取试剂盒、cDNA合成试剂盒购自德国Qiagen公司，SYBR Green购自日本TaKaRa公司，MX 3000P型PCR仪购自美国STRATAGENE公司，所有引物由上海生工生物技术工程有限公司合成。

1.3 实验方法

1.3.1引物合成与设计 根据GenBank中TUBB3的cDNA序列设计引物如下。TUBB3:Forward 5′-CAGCAAGGTGCGTGAGGA-3′，Reverse 5′-AGC-CGGGCATGAAGAAGT-3′，扩增片段长度353 bp；β-actin：Forward 5′-CTGGGACGACATAGGAGAA-AA-3′，Reverse 5′-AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC-3′，扩增片段长度564 bp。

1.3.2荧光定量PCR检测 按照试剂盒操作说明提取肿瘤石蜡组织RNA，进行逆转录合成cDNA，逆转录反应体系:dNTP 1 μL,RNA 2 μL，DEPC-H2O 4 μL，引物0.5 μL，逆转录酶0.5 μL，Buffer 2 μL。反应条件为：42 ℃ 30 min，95 ℃ 5 min。上机进行检测。定量PCR反应体系5 μL,包括Master Mix 2.5 μL，模板cDNA 1 μL,上下游引物各为0.25 μL,H2O 1 μL。扩增反应条件如下:94 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，69 ℃ 2 min，共40个循环；最后69 ℃ 8 min。利用软件分析其Ct值，计算TUBB3与β-actin的相对表达值。

1.4 随访资料的收集

随访方式包括:电话随访、定期复查。随访时间为手术当天到死亡或末次随访时间，截至2013年8月31日。疗效评估和观察指标如下。①无瘤生存期(DFS)：为手术后至病人疾病复发或死亡时间。②总生存期(OS)：为手术后至病人死亡时间或最后1次随访的日期。

1.5 统计学方法

应用SPSS 19.0软件进行统计学分析，计数资料比较采用χ2检验，生存分析采用Kaplan-Meier法，生存分析比较采用Log-rank检验，预后多因素分析采用Cox比例风险回归模型，具体赋值为：性别(1=男性，0=女性)，年龄(1=≤65岁，0=>65岁)，病理类型(1=鳞癌，2=腺癌，3=其他)，分化程度(1=高分化，2=中分化，3=低分化)；TNM分期(1=ⅡA期，2=ⅡB期，3=ⅢA期)，TUBB3 mRNA表达水平(1=低表达，0=高表达)，用逐步回归法进行分析，检验水准α=0.05，以P<0.05为差异有显著意义。

2 结 果

2.1 TUBB3 mRNA表达与病人临床特征的关系

本文88例病人TUBB3 mRNA表达中位值为0.269 8(0.001 6～1.866 1)，以各基因表达中位值为界，分为高表达组和低表达组。TUBB3 mRNA表达与病人性别、年龄、肿瘤病理类型、肿瘤病理分期、肿瘤分化程度均无显著相关性(P>0.05)。见表1。

表1 TUBB3 mRNA表达与NSCLC病人临床病理特征的关系(例)

2.2 TUBB3 mRNA表达与术后辅助化疗疗效和预后的关系

TUBB3 mRNA低表达者中位DFS为37个月，高表达者中位DFS为23个月，差异无显著性(P>0.05)；TUBB3 mRNA低表达者中位OS为51个月，高表达者中位OS为32个月，差异有显著性(χ2=5.205，P<0.05)。单因素分析显示，TUBB3 mRNA表达水平、分化程度、TNM分期是影响Ⅱ～ⅢA期NSCLC病人OS的危险因子。将单因素分析有显著性因子纳入Cox回归模型行多因素分析显示，TUBB3 mRNA表达水平(RR=0.453，95%CI:0.267～0.768，P<0.05)、TNM分期(RR=1.629，95%CI:1.158～2.293；P<0.05)为病人独立不良预后因素。

3 讨 论

NSCLC主要包括腺癌和鳞癌，约占全部肺癌的80%，其术后5年生存率仅30%左右[2]。目前对于Ⅱ～ⅢA期的NSCLC病人，在根治性切除术后接受铂类联合三代抗肿瘤新药(紫杉醇、长春瑞滨、吉西他滨)的辅助化疗已成为标准治疗模式。一项权威的关于肺癌辅助化疗的Meta分析显示，手术联合以铂类为基础的辅助化疗较单纯手术治疗更有助于提高病人的总生存率[3]。但是因为化疗药物的毒副作用及耐药性，NSCLC完全切除术后辅助化疗的疗效欠佳。目前，肺癌的规范化治疗方案是以病理类型、临床分期为依据，以大型临床试验的循证医学证据为标准，重点考虑的是相同临床特征病人群体的治疗策略，缺乏个体化治疗方法的思考，其结果并未给大多数肺癌病人的预后带来实质性的改变。随着基因组学和蛋白质组学的发展，肺癌个体化基因表达与病人化疗药物疗效及预后的关系越来越受到广大研究者的重视。分子标志物预测预后和指导治疗已成为一种新的治疗模式。

抗微管类化疗药物是作用于细胞微管，通过影响纺锤体形成，从而抑制细胞有丝分裂的一类广谱化疗药物。研究显示，TUBB3 mRNA表达水平与抗微管类化疗药物的疗效及耐药性相关，尤其是接受了紫杉醇或者长春瑞滨治疗的病人。GAN等[4]采用siRNA技术将NSCLC细胞株NCI-H460和细胞株Calu-6的TUBB3表达降低，从而使这两种肺癌细胞株对长春瑞滨的敏感性明显提高。然而，TUBB3在NSCLC术后辅助化疗中作用，目前研究结果不一。REIMAN等[5]研究结果表明，TUBB3高表达是一个不良的预后因素，TUBB3低表达能从NSCLC辅助化疗中获益。ZHANG等[6]研究显示，对于完全切除术后接受辅助化疗的NSCLC病人来说，TUBB3阳性病人的中位OS明显小于阴性病人，TUBB3是一个重要的预后因子。但是也有学者得出不同的结果，SEVE等[7]研究结果显示，在接受术后长春瑞宾及顺铂辅助化疗的病人中，TUBB3高表达的病人，其DFS和OS均长于低表达的病人。ZHANG等[8]采用免疫组织化学方法检测了85例手术切除NSCLC病人肿瘤组织，所有病人术后接受长春瑞滨并顺铂或长春瑞滨并卡铂化疗，TUBB3阳性表达者相对于阴性表达者，有更长DFS，OS也有延长的趋势，Cox多因素分析结果显示，病理分期和TUBB3阳性表达是影响DFS独立预测因素。

本研究因选取的88例NSCLC病人均行根治性手术，术后没有可观察的病灶，我们以生存时间来推测化疗效果。研究结果显示， TUBB3 mRNA低表达者OS长于高表达者，差异有显著意义；与高表达者相比有DFS延长的趋势，虽然差异无显著意义，但不排除由于入组病例偏少所致；Cox多因素分析显示，TUBB3 mRNA高表达、肿瘤TNM分期是独立的不良预后因素。说明TUBB3 mRNA表达与NP方案辅助化疗的疗效有关，TUBB3 mRNA低表达病人接受长春瑞滨化疗的效果较好，生存时间长，TUBB3 mRNA高表达病人预后差，不宜接受长春瑞滨化疗，可选用其他化疗药物。

综上所述，NSCLC病人TUBB3 mRNA表达可以指导化疗药物的应用。通过基因检测，选择最适合的辅助化疗方案，达到疗效的最大化和副作用的最小化，将是未来治疗肿瘤的一种趋势。

[参考文献]

[1] ZHANG H L, RUAN L, ZHENG L M, et al. Association between class Ⅲ β-tubulin expression and response to paclitaxel/vinorebine-based chemotherapy for non-small cell lung cancer: a meta-analysis[J]. Lung Cancer, 2012,77(1):9-15.

[2] 金翔凤,罗宜人,王明钊,等. 非小细胞肺癌病人外周血MUC1基因定量表达及意义[J]. 齐鲁医学杂志, 2010,25(1):8-9,12.

[3] PIGNON J P, TRIBODET H, SCAGLIOTTI G V, et al. Lung adjuvant cisplatin evaluation: a pooled analysis by the LACE Collaborative Group[J]. Clin Oncol, 2008,26(21):3552-3559.

[4] GAN P P, PASQUIER E, KAVALLARIS M. Class Ⅲ beta-tubulin mediates sensitivity to chemotherapeutic drugs in non small cell lung cancer[J]. Cancer Res, 2007,67(19):9356-9363.

[5] REIMAN T, LAI R, VEILLARD A S, et al. Cross-validation study of class Ⅲ beta-tubulin as a predictive marker for benefit from adjuvant chemotherapy in resected non-small-cell lung cancer: analysis of four randomized trials[J]. Ann Oncol, 2012,23(1):86-93.

[6] ZHANG S, LI Q, ZHANG Q, et al. Expression of ERCC1 and class Ⅲ β-tubulin in resected non-small cell lung cancer and its correlation with platinum-based adjuvant chemotherapy[J]. Int J Biol Markers, 2010,25(3):141-149.

[7] SEVE P, LAI R, DING K, et al. Class Ⅲ beta-tubulin expression and benefit from adjuvant cisplatin/vinorelbine che-motherapy in operable non-small cell lung cancer: analysis of NCIC JBR.10[J]. Clin Cancer Res, 2007,13(3):994-999.

[8] ZHANG Y, YANG H, LIU J, et al. High expression levels of class Ⅲ β-tubulin in resected non-small cell lung cancer patients are predictive of improved patient survival after vinorelbine-based adjuvant chemotherapy[J]. Oncol Lett, 2013,6(1):220-226.