脉冲强光对鲜牛奶细菌杀菌效果的研究

, , , ,,

(1.沈阳农业大学食品学院,辽宁沈阳110866;2.渤海大学化学化工与食品安全学院,辽宁锦州121013)

随着人们生活水平的提高,人们对食品的营养和安全品质、新鲜度、色泽以及口感都有了越来越高的要求,传统的杀菌技术已经不能满足现代人对食品的需要。脉冲强光技术是近年来发展起来的一种新型物理非热杀菌技术[1]。它利用瞬时、高强度的脉冲光能量杀灭食品中的各类微生物,避免了传统热杀菌对热敏性物质的破坏和化学杀菌带来的食品安全隐患[2-4]。

牛奶不仅含有优质蛋白质而且含有人体所需的多种维生素及矿物质以及多种免疫活性因子,被誉为白色血液[5]。但是,在牛奶加工及储藏过程中由于细菌的污染而导致牛奶货架期短、奶制品品质下降等问题的存在,严重影响了人们对摄取牛奶营养的要求。本实验研究脉冲强光对鲜牛奶细菌灭菌的效果,为能有效控制鲜牛奶加工及储藏过程中细菌污染的程度,同时延长货架期,并为生产高品质鲜奶制品奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鲜牛奶 锦州市某自营牧场(实验测得:脂肪:3.21g/100g、蛋白质:3.08/100g、非脂乳固体:8.62g/100g);平板计数琼脂 北京奥博星生物技术有限公司。

LA50-800H脉冲强光表面杀菌实验柜 宁波中物光电杀菌技术有限公司;LRH-150恒温生化培养箱、DHG-9055A电热鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司;SW-CJ-2FD洁净工作台 苏州安泰空气技术有限公司;EC2菌落计数分析仪 法国生物梅里埃集团;HH-6数显恒温水浴锅 金坛市鑫鑫实验仪器厂;AR224CN电子天平 奥豪斯仪器(上海)有限公司PHS-3CW pH计 上海般特仪器制造有限公司;YXQ-LS-75S11立式全自动压力灭菌锅 北京科创百万科技发展有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 鲜牛奶的处理 在超净工作台上用移液枪分别吸取5、10、15、20、25mL的鲜牛奶于无菌培养皿中。

1.2.2 脉冲强光处理 打开脉冲强光实验柜,先自行运行10min让仪器稳定后启动,将盛有鲜牛奶的培养皿放入实验柜的中央,关上柜门,设定实验柜的不同实验参数用脉冲强光对牛奶样品进行闪照处理,每隔5min处理一次。

1.2.3 实验数据设定 在闪照距离13cm、闪照能量300J、样液厚度2mm的相同条件下,闪照频率为:10、20、30、40、50Hz;在闪照频率30Hz、闪照能量300J、样液厚度2mm的相同条件下,闪照距离为:12、13、14、15、16cm;在闪照频率30Hz、闪照距离13cm、样液厚度2mm的相同条件下,闪照能量为:100、200、300、400、500J;在闪照频率30Hz、闪照距离13cm、闪照能量300J的相同条件下,样液厚度为:1、2、3、4、5mm。

1.2.4 菌落计数 将处理后的不同鲜牛奶样品,采用平板计数法和倾倒法测定[6],并用菌落计数分析仪对细菌菌落计数,每次实验做3次平行,结果取平均值。

1.2.5 灭菌率的计算 灭菌率的计算公式如下:

灭菌率(%)=[(初始菌落数-处理菌落数)/初始菌落数]×100

1.2.6 单因素实验 以闪照频率(Hz)、闪照距离(cm)、闪照能量(J)和样液厚度(mm)四个因素为自变量设计实验,研究脉冲强光对鲜牛奶中细菌杀灭效果的影响[7-9]。

1.2.7 响应面实验设计 根据Box-Behnken中心组合设计原理[10-11]在单因素实验的基础上,以闪照频率、闪照距离、闪照能量以及样液厚度四个因素为自变量,细菌总数的灭菌率为响应值,作四因素三水平响应面分析实验,响应面实验因素水平表如表1所示。

表1 响应面实验因素水平表Table 1 Factors and levels in response surface design

2 结果与分析

2.1 闪照频率对细菌灭菌率的影响

脉冲强光照射频率对鲜牛奶细菌的灭菌效果如图1所示。

图1 闪照频率对细菌灭菌率的影响 Fig.1 Effect of flash frequency on disinfection rate of bacterium

由图1可看出,脉冲强光的闪照频率与细菌的灭菌率成正相关,闪照频率在0～30Hz阶段,灭菌效果增加较为明显,在30～50Hz范围内,随着闪照频率的增加,细菌的灭菌率增长得不明显,因此闪照频率为30Hz时具有最佳的杀菌效果。

2.2 闪照距离对细菌灭菌率的影响

脉冲强光照射距离对鲜牛奶细菌的灭菌效果如图2所示。

图2 闪照距离对细菌灭菌率的影响 Fig.2 Effect of flash distance on disinfection rate of bacterium

由图2可看出,细菌的灭菌率随着闪照距离的增加总体上有逐渐下降的趋势,闪照距离在12～13cm之间,细菌的灭菌率只增加了0.58%,这说明在这个范围内,脉冲强光对牛奶细菌的灭菌效果基本相同;在13～16cm范围内,脉冲灯光与处理样品越近,达到的灭菌效果也越明显,可得出在13cm处达到了最佳的灭菌效果。

2.3 闪照能量对细菌灭菌率的影响

脉冲强光照射能量对鲜牛奶细菌的灭菌效果如图3所示。

图3 闪照能量对细菌灭菌率的影响 Fig.3 Effect of flash energy on disinfection rate of bacterium

由图3可看出,在图中的5个能量点中,脉冲强光在300、400、500J三个能量值达到了较高灭菌率,在100J和200J的能量值时都处于上升阶段,这就说明脉冲强光对细菌的灭菌率会随着能量的增强而升高,但到了300J时,灭菌率升高的程度很缓慢,并结合对能量消耗的考虑,得出闪照能量300J时灭菌效果最佳。

2.4 样液厚度对细菌灭菌率的影响

鲜牛奶的样液厚度对脉冲强光的灭菌效果影响如图4所示。

图4 样液厚度对细菌灭菌率的影响 Fig.4 Effect of thickness of the liquid sample on disinfection rate of bacterium

由图4可看出,脉冲强光的灭菌率随着样液厚度的增加逐渐降低,是因为脉冲强光作为一种紫外线至近红外线区域的光线,其穿透力具有一定的限度,综合实验的条件和实际情况可以得出样液的厚度2mm时的灭菌效果最好。

2.5 脉冲强光对鲜牛奶细菌灭菌条件的优化

依据表2的实验结果,利用Design-Expert 8.0.6软件对处理的数据进行回归分析[12-13],拟合后得到关于闪照频率(A)、闪照距离(B)、闪照能量(C)和样液厚度(D)的二次多项回归方程:

Y=99.48+0.58A-1.58B+2.99C-1.70D+0.16AB-2.46AC-3.14AD-2.19BC-0.83BD+0.36CD-9.42A2-3.13B2-5.62C2-6.49D2

表2 Box-Behnken 实验设计优化方案及结果Table 2 Optimization project design and experimental results of Box-Behnken design

对该回归模型进行方差分析,其结果可见表4。由表4可知,回归模型极显著(p<0.0001),失拟项不显著(p=0.0764>0.05),表明失拟项相对于绝对误差不显著,说明该模型在统计学上有意义并拟合性良好;相关系数R2=0.9709,说明该回归模型的各个因素和响应值之间有良好的线性关系,能够筛选出最佳的工艺条件[14]。

表3 细菌灭菌率方差分析Table 3 Variance analysis of bacterial sterilization rate

在表3中,p值(0.01

在表4中,闪照频率A的影响不显著(p=0.0635>0.05),闪照距离B、闪照能量C和样液厚度D的影响极显著(p<0.0001);交互项AC(p<0.01)、AD(p<0.01)和BC(p<0.01)的交互作用对细菌灭菌率的影响极显著,BD(p<0.05)的影响显著;交互项AB(p=0.2482)和CD(p=0.4822)交互作用的影响不显著。综合上述分析得知,各个因素对响应值的影响程度为:C(闪照能量)>D(样液厚度)>B(闪照距离)>A(闪照频率)。

2.6 响应面图分析

利用Design-Expert 8.0.6软件对回归方程构建响应面分析图。由图5～图8中的最高稳定点及等高线面可以看出,交互项闪照频率A和样液厚度D、闪照频率A和闪照能量C、闪照距离B和闪照能量C的交互作用极显著,交互项闪照距离B和样液厚度D的交互作用显著,交互项闪照能量C和样液厚度D的交互作用不显著。由图5可知,在一定的范围内,细菌的灭菌率随着闪照频率及闪照能量的增加而增加。根据二次多项式的回归方程,结合回归模型的数学分析,对回归方程进行一阶偏导等于零,可得到响应曲面的最大值点[16-17],整理可得出最佳条件参数 A=28.5,B=12.68,C=344,D=1.98,即脉冲强光杀灭细菌的最佳条件为脉冲强光的闪照频率为28.5Hz,闪照距离为12.68cm,闪照能量为344J,样液厚度为1.98mm,并且考虑到脉冲强光设备、生产实际条件和生乳食品安全国家标准,将脉冲强光的最佳闪照条件调整为:闪照频率29Hz,闪照距离12.8cm,闪照能量300J,样液厚度2mm。在此最佳参数条件下进行了3次重复验证实验,细菌灭菌率平均值达到99.996%,实验结果与预测值吻合,该回归模型可用于脉冲强光杀灭鲜牛奶细菌的条件优化。

表4 回归方程统计分析Table 4 Statistical analysis of regression equation

图5 Y-f(A,C)响应面图 Fig.5 Response surface of the effects of A and C on the disinfection rate

图6 Y-f(A,D)响应面图 Fig.6 Response surface of the effects of A and D on the disinfection rate

图7 Y-f(B,C)响应面图 Fig.7 Response surface of the effects of B and C on the on the disinfection rate

图8 Y-f(B,D)响应面图 Fig.8 Response surface of the effects of B and D on the on the disinfection rate

3 结论

本实验研究了闪照频率、闪照距离、闪照能量和样液厚度四个因素与脉冲强光对鲜牛奶细菌杀灭效果的影响,在单因素实验的基础上,通过响应面分析优化,建立实验回归模型,得到了脉冲强光灭菌的最佳工艺条件为闪照频率29Hz,闪照距离12.8cm,闪照能量300J和样液厚度2mm,细菌的灭菌率达到99.996%。

[1]王纯冰,孔庆财,徐伟,等. 脉冲强光对流动水中大肠杆菌的杀灭效果研究[J]. 食品科技,2011,36(4):36-40.

[2]张佰清,陈丹等. 脉冲强光对青霉菌的杀菌实验研究[J]. 食品科技,2007,31(10):43-45.

[3]张佰清,姜树才,刘佳. 脉冲强光处理对金黄色葡萄球菌杀菌效果的研究[J]. 食品科技,2009,34(1):91-93.

[4]袁勇军,唐敏,陈伟,等. 冲强光对连续流动状态下黄酒杀菌效果及品质的影响[J]. 中国酿造,2011,3(1):71-73.

[5]蒋明明. 脉冲强光对典型微生物灭活效能与机理研究[D]. 哈尔滨:东北林业大学,2011.

[6]中华人民共和国卫生部 GB 4789.2-2010 食品微生物学检验 菌落总数测定[S]. 北京:中华人民共和国国家标准,2010.

[7]Gem ma Oms-Oliu,Ingrid Aguilo-Aguyo,Olga Martin-Bellos,etal. Effects of pulsed light treatments on quality and antioxidant properties of fresh-cut mushroom[J]. Postharvest Biology and Technology，2010,56:216-222.

[8]Marcos Jc,Fonsecalp,Ramalho Mt,etal. Application of surface response analysis to optimize of penicillin acylase purification in aqueous two-phase systems[J]. Enzyme and Microbial Technology,2002,31:1006-1009.

[9]Balakrishnan P A,Arunagirl A,Rao P G. Ozone generation by silent electric discharge and its application in tertiary treatment of tannery effluent[J]. Journal of Electrostatics,2002,56:77-86.

[10]王淑霞,李爱梅,张俊杰,等. 响应面分析法龙眼核中多酚物质提取工艺[J].食品科学,2011,32(10):35-39.

[11]赵猛,朱洪梅. 小米黄色素超声波辅助提取工艺的响应面法优化[J]. 西北农林科技大学学报,2009,37(10):182-187.

[12]Hu J Y,Chu X N,Quek P H,etal. Repair and regrowth of Escherichia coli after low-and medium-pressure ultraviolet disinfection[J]. Water Science & Technology:Water Supply,2005,5(5):101-108.

[13]M O Buffle,J Schumacher,E Salhi,etal. Ozonation and Advanced Oxidation of Waste water:Effect of O3Dose,PH,DOM and HO-Scavengers on Ozone Decomposition and HO-Generation. Ozone:Science and Engineering,2006,28(4):247-259.

[14]麻成金,吴竹青,黄伟,等. 响应面法优化茶叶籽油超临界二氧化碳萃取工艺[J]. 食品科学,2011,32(20):108-113.

[15]张维,李雪雁,张秀兰,等. 响应面分析法优化菊芋渣中蛋白的提取工艺[J].食品工业科技,2012,33(1):305-307.

[16]王伟. 响应面分析法优化花生壳黄酮类化合物提取工艺及其抗氧化活性研究[J].安徽农业学报,2011,39(22):1352-13523.

[17]孙哲浩,李宝珍,赵谋明,等. 响应面分析法优化荔枝核总黄酮提取工艺的研究[J].食品与机械,2006,22(1):30-32.