枯草芽孢杆菌K-6-9发酵条件优化及放大

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(上海海洋大学上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心,上海 201306)

微生态添加剂以其天然、绿色、无毒副作用、无残留的优点近年内引起世界各国的关注,并逐步成为替代抗生素添加剂的主力[1]。甘露寡糖以低热、安全、无毒,而且能改善动物体内微生物环境、提高动物免疫力等特有的功效引起人们极大的兴趣。在健康养殖的趋势下,甘露寡糖替代抗生素的使用已成为研究热点,是最有研究前景的抗生素替代品之一[2-3]。甘露聚糖酶(mannanase)是一种半纤维素水解酶,是制备甘露寡糖的关键酶之一,其以内切方式降解甘露聚糖糖苷键,降解产物的非还原末端为甘露糖、甘露寡糖。甘露聚糖酶来源广泛,而微生物是甘露聚糖酶的主要来源,其中利用分泌甘露聚糖酶微生物菌种制备直投式发酵剂,可以大大降低工厂制备甘露寡糖的过程,并具有降低环境污染等优势。

现在市面上主要是以魔芋作为甘露聚糖的主要来源,而目前市场上为数不多的寡糖类产品寡糖纯度只在35%～55%,而且因含单糖和淀粉类物质而难于保存[4]。我国是啤酒酵母生产大国,废弃的啤酒酵母细胞壁中同样含有丰富的甘露聚糖,甘露聚糖占酵母细胞壁干重的40%左右[5],甘露聚糖存在于酵母细胞壁外层[6],以共价键形式与蛋白质连在一起,因此又称之为甘露聚糖蛋白[7]。因此利用啤酒酵母中甘露聚糖,制备高纯度的甘露寡糖,已经成为近几年的研究热点。

本实验室前期分离改良的枯草芽孢杆菌K-6-9在生长过程中能产生大量的异甘露聚糖酶酶活力高达601.6U/mL[21],能将啤酒酵母细胞壁中的甘露聚糖分解成甘露寡糖。本实验以芽孢量为指标,将枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)K-6-9首先进行摇瓶发酵,通过培养基及其发酵条件的优化研究,然后进行扩大培养,为该菌株后期制成直投式发酵剂提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)K-6-9由本实验室分离保藏;种子培养基和基础发酵培养基 葡萄糖5g/L、牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 5g/L、pH7.0[8];菌种、芽孢计数和保藏培养基 葡萄糖5g/L、牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 5g/L、琼脂2g/L、pH7.0。

PL-202-L型电子天平 梅特勒-托多利仪器(上海)有限公司;WFZ UV-200型紫外可见分光光度计 尤尼科(上海)仪器有限公司;DHG-9053A型电热鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司;SJH-4S型数控精密恒温水浴锅 宁波天恒仪器厂;pH S-3C酸度计 雷磁仪器厂;DKY-Ⅱ型 恒温调速回转式摇床 上海杜科自动化设备有限公司;FMG(I)型台式发酵罐 上海国强生化工程装备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 活菌数和芽孢数的测定 活菌数:将发酵液稀释至10-3～10-7,然后取10μL涂布于固体培养基平板上,每个浓度3个重复,18h后计算活菌数。芽孢数:将发酵液置于80℃水浴10min按照活菌的测定方法进行测定[9-11]。

1.2.2 发酵液pH的测定 取发酵液直接用精密pH计测定。

1.2.3 菌种活化及种子液的配制 从冰箱中取出枯草芽孢杆菌斜面菌种,室温静置40min;用接种环从斜面取厚实二环菌种接种于三角瓶液体培养基上,37℃、160r/min摇床活化培养18h,此时活菌数约为108CFU/mL,芽孢量约为105CFU/mL作为种子菌液备用[12]。

1.2.4 培养时间的确定 50mL/250mL(以下同)的三角瓶液体培养基中接入2.0%枯草芽孢杆菌K-6-9原菌液,置于37℃,160r/min摇床活化培养24h,其间每隔3h取样测定菌液活菌数和芽孢量确定最佳培养时间。

1.2.5 枯草芽孢杆菌K-6-9培养基成分的优化 最佳碳源筛选:分别以含量为1%(W/V)的蔗糖、乳糖、麦芽糖、乳糖、棉籽糖、果葡糖浆等6种碳源去替换初始发酵培养基中的葡萄糖,其他成分变,以葡萄糖为对照。按2%的接种量接种种子液,于160r/min、37℃条件下摇瓶培养18h,每个处理做个3重复,通过芽孢产量进行对比选择(以下同)。

最佳氮源筛选:分别以含量为1%(W/V)的牛肉膏、酵母粉、胰蛋白胨、尿素、NH4NO3、NH4Cl、等6种氮源去替换初始发酵培养基中的鱼粉蛋白胨,以鱼粉蛋白胨对照。其它发酵条件同上,通过芽孢产量进行对比选择。

最佳无机盐筛选:根据先相关文献[13-16],分别以含量为 0.3%(W/V)的MnSO4、MgSO4、KH2PO4、NaCl,CaCl2等5种无机盐去替换初始发酵培养基0.5%(W/V)NaCl,以0.5%(W/V)NaCl和不添加为对照。其它发酵条件同上,通过芽孢产量进行对比选择。

1.2.6 正交实验优化培养基成分 对筛选得到的最佳碳源蔗糖(A)和最佳氮源胰蛋白胨(B)以及发酵培养基中促生长无机盐CaCl2(C),MgSO4(D),KH2PO4(E),进行5因素4水平的正交实验,考虑到碳源与氮源之间的互作,采用 L16(45)正交表确定各组分的最佳配比,共16个处理组合,每个处理做4个重复。正交实验各因素及水平见表1。

表1 正交实验因素水平Table 1 Factors and levels in orthogonal experiment

1.2.7 草芽孢杆菌K-6-9培养条件的优化

1.2.7.1 最适接种量的测定 按照1%、2%、3%、4%、5%、6%的接种量将种子液分别接到50mL/250mL优化后的发酵液中(以下同),培养18h,通过芽孢产量进行对比选择。

1.2.7.2 最适生长pH的测定 发酵培养基初始pH设置为5.5、6.0、6.5、7.0、7.2、7.5、8.0,按照最佳接种量接入优化后发酵液中,在37℃培养18h,通过芽孢产量进行对比选择。

1.2.7.3 最适生长温度的测定 温度设置为28、32、35、37、39、42℃,按照最佳接种量接入优化后发酵液中,在不同温度下培养18h,通过芽孢产量进行对比选择。

1.2.7.4 最适转速的测定 将枯草芽孢杆菌以合适接种量接到优化后发酵培养基中,摇床转速分别调节为 120,140、160、180、200、220r/min;按照最佳接种量接入优化后发酵液中,在最适生长温度下培养18h,通过芽孢产量进行对比选择。

1.2.8 扩大培养 采用5L发酵罐,接种量和发酵量均和摇瓶发酵条件相同,通气量维持在3vvm[17]。发酵条件:优化后的最优发酵条件相同。每2h测定细菌数和芽孢量。

1.3 数据处理方法

实验中图表绘制采用 Microsoft Excel处理;正交实验设计与方差分析应用软件为正交设计助手v3.1[18]。

2 结果与分析

2.1 培养时间的确定

从图1可以看出:随着培养时间的延长,在0～3h内活菌数生长较慢,处于停滞期;而后迅速生长,3～18h细菌数内生长很快,到 18h活菌数接近顶峰,即这一阶段是对数生长期,菌体数量急剧增多,活菌数迅速提高;18h以后活菌数有微降趋势,但变化不大,即K-6-9已进入生长的稳定期。芽孢量在前9h变化不大,几乎没有增长,9～18h增长迅速,18～24h芽孢产量趋于稳定即进入平台期。故本实验选择的最适合的发酵时间是18h。因此,实验采用接种种龄为18h,此时枯草芽孢杆菌进入对数生长末期,既可保持高的细胞活力,又可获得尽可能多的芽孢量。

图1 枯草芽孢杆菌K-6-9生长曲线 Fig.1 Growth curve of Bacillus subtilis

2.2 枯草芽孢杆菌K-6-9培养基成分的优化

2.2.1 碳源的筛选 碳源的单因素筛选结果如图2所示,当蔗糖作为碳源时,发酵后菌量最大,芽孢量达到1.50×106CFU/mL,其后芽孢量的大小依次为果糖>乳糖>棉籽糖>葡萄糖>麦芽糖>果葡糖浆。所以根据芽孢量数据,蔗糖应为最佳碳源。

图2 不同碳源对 K-6-9发酵液的影响 Fig.2 Effects of different carbon source on the fermentation of K-6-9

2.2.2 氮源的筛选 对氮源进行单因素筛选,当胰蛋白胨作为氮源时,发酵后芽孢量最大,芽孢量达到1.94×106CFU/mL,其余根据芽孢量的大小依次为鱼粉蛋白胨>牛肉膏>酵母粉>NH4NO3>NH4Cl>尿素(图3)。根据芽孢量,胰蛋白胨应为最佳氮源。

图3 不同氮源对K-6-9发酵液的影响 Fig.3 Effects of different nitrogen sources on the fermentation of K-6-9

2.2.3 无机盐的筛选 对枯草芽孢杆菌K-6-9进行无机盐单因素筛选,当KH2PO4作为无机盐添加时,发酵后芽孢量最大,达到5.16×107CFU/mL,其余芽孢量大小依次为MgSO4>CaCl2>0.5%(W/V)NaCl>NaCl>不添加无机盐>MnSO4(图4)。

图4 不同无机盐对K-6-9发酵液的影响 Fig.4 Effects of different inorganic salts on the fermentation of K-6-9

综合上述数据可以看出,KH2PO4和MgSO4、CaCl2在促进K-6-9发酵时,对芽孢量的生长有促进作用,NaCl对于芽孢量影响较小,后文不再考虑。根据芽孢量,CaCl2相比较KH2PO4和MgSO4影响较小,故选取KH2PO4和MgSO4作为无机盐。

2.3 正交实验优化比培养基成分

通过上述碳源、氮源以及无机盐单因素实验的研究,确定了液体发酵培养基的最佳碳源、氮源和无机盐的种类和浓度范围。按1.2.6设计的正交实验优化培养基成分,确定最合适的培养基成分。

从表2可以看出,对枯草芽孢杆菌K-6-9生长影响因素的顺序为胰蛋白胨>蔗糖>KH2PO4>MgSO4>CaCl2。实验结果表明胰蛋白胨、蔗糖、MgSO4、KH2PO4对发酵效果影响较为显著。实验数据分析枯草芽孢杆菌K-6-9的最佳工艺组合为A3B1C1D2E3,即最佳培养基成分为蔗糖1.0%、胰蛋白胨0.25%、MgSO40.2%、KH2PO40.3%、CaCl20.1%、牛肉膏0.5%,芽孢产量为1.294×109CFU/mL。

由表3方差分析可以看出,胰蛋白胨、蔗糖、MgSO4、KH2PO4用量对芽孢产量的影响显著,CaCl2影响不显著,此结果与正交实验结果的极差分析结论一致。

2.4 最佳培养条件的筛选

2.4.1 最佳接种量的确定 测定了1%、2%、3%、4%、5%、6%,6个接种量对芽孢量的影响。实验结果表明接种量在一定范围内增大芽孢量有所增加,但过量的接种量可能导致培养基养分提前消耗完,降低芽孢的数量[19]。实验结果表明2%的接种量为最适接种量。

表2 枯草芽孢杆菌K-6-9 最适培养基成分L16(45)正交实验结果Table 2 L16(45)orthogonal design and results for liquid medium optimization

表3 正交结果方差分析Table 3 Variance analysis of the results

图5 接种量对芽孢产量的影响 Fig.5 Effect of seed volume on spore yield

2.4.2 最佳初始pH的确定 测定了5.5、6.0、6.5、7.0、7.2、7.5、8.0,7个pH对芽孢量的影响。发酵培养基初始pH为 5.5～7.0时,与芽孢量增殖呈正相关:7.0～8.0 时呈负相关(图7)。当pH为7.0时最适于芽孢量增殖。

图6 初始 pH 对芽孢产量的影响 Fig.6 Effect of initial pH value of media on spore yield

2.4.3 最佳发酵温度的确定 分别在不同温度下进行发酵培养,结果表明发酵温度为37℃最有利于芽孢量的增殖,综上所述选择37℃为本实验最佳发酵温度。

图7 发酵温度对芽孢产量的影响 Fig.7 Effect of temperature on spore yield

2.4.4 最佳转速的确定 在所设的6个不同处理中,当摇床转速为180r/min时,菌体产量明显高于其他处理(图9)。因此选择180r/min作为本实验的最佳转速。

图8 转速对芽孢产量的影响 Fig.8 Effect of shaking speed on spore yield

2.5 扩大培养验证实验

在摇瓶的基础上进行了5L的扩大培养,实验结果如图9。

图9 枯草芽孢杆菌K-6-9扩大培养 在不同时间段活菌数、芽孢量和pH的变化 Fig.9 Amplification of Bacillus subtilis K-6-9 effect of fermentation time on living cell、spore yield and pH

通图9可以看出,枯草芽孢杆菌扩大培养生长周期和摇瓶的时间周期有变化,可能由于通气后加速了枯草芽孢杆菌K-6-9的生长,其在14h获得了最大细菌数和芽孢量。发酵液的pH先由7.00 降低到5.83,后来逐渐上升到6.71。改良后发酵液的芽孢量为1.40×109CFU/mL相对于初始发酵培养基的芽孢量5.5×105CFU/mL,提高了2.55×103倍。

综合上述实验,得到优化后的发酵培养基配方为:蔗糖1.0%,胰蛋白胨0.25%,牛肉膏0.5%,MgSO40.2%,KH2PO40.3%,CaCl20.1%。确定了摇瓶的最佳培养条件:初始 pH 7.0,装液量为 50mL/250mL,接种量为 2%,发酵温度为 37℃,转速为180r/min,发酵时间为 18h。摇瓶发酵芽孢量为1.32×109CFU/mL,发酵罐通气量为3vvm,芽孢量为1.40×109CFU/mL。

3 讨论

异甘露聚糖酶生产菌株K-6-9在批量生产制备成直投式发酵剂过程中最为重要的是以芽孢量为主要质量指标。因此,本研究以芽孢量作为该菌株发酵条件的评判指标。目前异甘露聚糖酶生产菌株发酵剂的应用国内外未见多报道,多为酶活力和制备甘露寡糖的研究。如王永[20]对于产异甘露聚糖酶菌株的复合诱变,张闻[6]等甘露聚糖酶产生菌F1-5的鉴定及发酵条件研究。王绍云[21]等采用由北京博仕奥生物技术有限公司提供,酶活≥ 20万 U/g的内切型中性β-甘露聚糖酶对棕榈粕进行酶解,得到以聚合度二、三、四、五为主的MOS等,对于发酵剂的研究较少。本实验室分离的菌株K-6-9产异甘露聚糖酶的酶活性较强,固态培养基酶活力最高达601.6U/mL[23]。本实验首次初步探讨了异甘露聚糖酶K-6-9的高密度发酵,为后期制备直投式发酵剂提供了实验基础。

相对于其它枯草芽孢杆菌等高密度发酵,本实验的芽孢量相对较少。这可能由于菌株的特殊性。 摇瓶发酵实验表明K-6-9生长需要较好的溶氧条件,在其他发酵条件一定的情况下,培养基中的溶氧水平越高越有利于芽孢的产生。在后期的实验中,将进行补料实验以便进一步优化和提高芽孢量。

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