猪链球菌毒力因子研究进展

马建华，魏建忠

（安徽农业大学动物科技学院，安徽合肥230000）

猪链球菌（Streptococcus suis，SS）呈世界范围流行，是一种重要的人兽共患病原菌［1］，根据猪链球菌表面荚膜多糖（capsular polysaccharide，CPS）的抗原性，可以将其分为35个血清型（1～34型和1/2型），其中毒力最强、临床检出率最高的血清型是猪链 球 菌 2 型 （Streptococcus suis serotype 2，SS2）［2-3］。2005年，四川省资阳市暴发了大规模的人感染SS2的疫情，病死率极高［4］，引起了高度关注。国内外研究认为猪链球菌的致病性与其毒力因子有密切关系，目前研究较多的猪链球菌主要毒力因子有荚膜多糖（capsular polysaccharide，CPS）、溶菌酶释放蛋白（muramidase-released protein，MRP）、胞外因子（extracellular protein factor，EF）和溶血素（suilysin，SLY）。

1 荚膜多糖

荚膜多糖由鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、N-乙酰葡萄糖胺和唾液酸等5个单糖组成，由于所含单糖种类及连接方式的不同，造成荚膜多糖的成分与结构不同。荚膜多糖的成分和结构与细菌的病原性和血清型有关，是致病性分离株所必需的组分。荚膜多糖在逃避机体免疫系统，保护细菌不被吞噬中扮演着重要角色。Houde M等［5］研究了SS2的荚膜多糖抗吞噬的分子机制，采用经热灭活的SS2荚膜多糖野生株和荚膜多糖缺失株与巨噬细胞共孵育，分别于1、6、24h后在激光共聚焦显微镜下观察，发现野生株较缺失株延迟和抑制了感染过程中一氧化氮的产生，表明荚膜多糖对细菌感染期一氧化氮信号通路存在抑制作用，从而破坏了细胞表面的脂质微区，阻止了乳糖苷神经酰胺的依赖识别作用，保护细菌抗巨噬细胞吞噬。胡丹等［6］通过对05ZYH33野生株和荚膜多糖缺失株生物学特性比较发现，缺失株由于失去表面黏多糖，成链能力减弱，失去与SS2荚膜特异抗血清发生凝集反应的能力，更易被全血清除，但对上皮细胞HEP-2的黏附能力增强，表明荚膜在细菌抵抗吞噬和细菌黏附过程中发挥重要作用。

2 溶菌酶释放蛋白和胞外因子

溶菌酶释放蛋白分子质量为136ku，是猪链球菌细胞壁上的大分子糖蛋白。Vecht U等［7］对180株自然感染SS2分离株进行研究，发现在致病性菌株中均含有溶菌酶释放蛋白和胞外因子蛋白，而在非致病株中却不含有这2种蛋白，推断这2种蛋白与SS致病性有紧密关系，是SS非常重要的毒力因子。曾巧英等［8-9］先后以HEP-2细胞和仔兔脾微血管内皮细胞为体外细胞模型，将纯化的溶菌酶释放蛋白溶液和细胞共孵育，光镜下观察，溶菌酶释放蛋白可以诱导HEP-2上皮细胞出现单个细胞或融合成多核巨细胞后凋亡的现象，表明溶菌酶释放蛋白具有诱导上皮细胞凋亡的功能。微血管内皮细胞亦可以和纯化的溶菌酶释放蛋白相互作用发生形态学变化进而凋亡，说明溶菌酶释放蛋白单独足以破坏大脑的血管内皮细胞屏障。

胞外因子分子质量为110ku，是仅能在细菌培养上清液中分离到的胞外蛋白。Fittipaldi N等［10］对100株SS的血清型和标记毒力基因的分布进行了研究，结果显示最普遍的表型是 MRP＋EFSLY-（40%）和 MRP-EF-SLY＋（35%）。研究表明，不同国家SS2分离株的溶菌酶释放蛋白和胞外因子的相对分子质量有所差异，如美国、澳大利亚、荷兰、西班牙等国家SS2致病株多数为大分子质量的溶菌酶释放蛋白和胞外因子，而北美加拿大的SS2致病菌株多为小分子质量的溶菌酶释放蛋白或超大分子质量的胞外因子。此外2种毒力因子都具有一定的免疫原性，但溶菌酶释放蛋白目前仅有截短的原核表达［11］，推测可能是由于溶菌酶释放蛋白对宿主菌的毒性作用导致其不能完整地正常合成。另有研究证明2种蛋白联合起来免疫，对链球菌保护力效果更佳［12］。

3 溶血素

溶血素属依赖胆固醇的细胞溶素家族，是SS生长过程中分泌的一种蛋白。溶血素由sly基因编码，分为2种类型，即对氧敏感的链球菌溶血素O（SLO）和对氧稳定的链球菌溶血素S（SLS），其分子质量分别为54ku和62ku。溶血素通过对机体血小板和淋巴细胞的损伤来破坏机体的凝血系统和免疫系统，溶血素阳性的SS可以破坏脉络丛上皮细胞，从而突破脑脊液屏障，出现脑膜炎症状［13］。Takeuchi D等［14］根据ST1型和ST104型菌株临床致病力方面的差异（ST1型和ST104型菌株均能引起败血症，但ST1型菌株更易引起脑膜炎的发生），在溶血素基因转录和mRNA翻译水平上进行对比分析，发现ST104型菌株产生低水平的溶血素。动物攻毒试验结果表明，溶血素基因敲除株感染组小鼠存活率显著增高，野生菌株感染组小鼠死亡前神经症状明显，攻毒后72h，2组感染小鼠血液与脑组织细菌分布出现显著差异。组织病理学分析显示，接种野生菌株组的小鼠脑组织血管扩张，出现大量中性粒细胞、单核巨噬细胞；而敲除株感染组的小鼠脑组织未出现明显出血现象，炎症细胞也较少，说明溶血素与SS导致的脑膜炎有关。Seitz M等［15］构建了猪链球菌CPS-SLY＋株和同源溶血素缺失株，体外溶血及对上皮细胞黏附、入侵试验结果发现，缺失株的体外溶血活性消失，CPS-SLY＋株的黏附、入侵作用均比溶血素缺失株显著增高，结果表明，溶血素促进了SS对上皮细胞的黏附和入侵作用。此外，对SS的溶血素细胞溶解作用研究中发现，溶血素介导入侵上皮细胞，造成细胞溶解时，并不需要像CDC家族那样在细胞膜上打孔来改变细胞通透性从而导致细胞溶解，其分子机制仍需进一步研究。

溶血素同时也是一种良好的免疫保护性抗原［16］。Liu L等［17］在分析SS2菌株05ZYH33全基因组序列的基础上，克隆表达了溶血素蛋白并对此蛋白进行了免疫保护评价，结果显示，溶血素具有明显免疫保护作用。Du H等［18］构建了重组溶血素蛋白（rSLY）和完全缺失溶血活性的点突变蛋白rSLY（P353L），通过动物试验，对诱导炎症反应及致死性攻击免疫保护方面做了评估。突变体rSLY与rSLY相比，突变体rSLY在反应前期刺激诱导产生了较低水平的IL-6、KC和IL-10；SS感染小鼠后被动免疫突变体rSLY抗血清，24h内未在小鼠体内检测到组织病变，表明突变体rSLY具有很好的免疫保护性。由于能够抑制SS感染早期引起的炎症反应，突变体rSLY可以作为防治SS中毒性休克的候选疫苗株。

虽然国内外公认SS的主要毒力因子是荚膜多糖、溶菌酶释放蛋白、胞外因子和溶血素［19］，但有研究表明，缺失或者敲除这些毒力因子后，菌株仍然具有毒力［20］。因此，新的毒力相关基因被不断发现和鉴定。

4 荚膜唾液酸

唾液酸作为荚膜多糖的单糖成分之一，又称N-乙酰神经氨酸。Lecours M P等［21］证明了唾液酸不是荚膜的主要抗原决定簇。董瑞萍［22］，王长军［23］等分别对唾液酸合成相关基因neuB和neuC进行敲除，发现敲除株荚膜明显变薄，质地更加紧密。小鼠致病试验中，敲除株毒力显著减弱。石洁等［24］构建了荚膜唾液酸缺失株并进行毒力对比试验，通过脑组织病理切片分析，在感染野生株的小鼠脑组织中可见显著的胶质细胞增生样结节，同时可见分散出血并伴随白细胞浸润，提示野生株能损害血脑屏障引起脑膜炎；体外小鼠全血细胞体系刺激试验，发现荚膜唾液酸缺失株刺激后炎性因子MCP-1、IL-6的分泌水平显著高于野生株组，提示荚膜唾液酸可能在宿主对SS2的识别与应答中发挥抑制作用。试验还对比了野生菌株和缺失株与宿主细胞的作用，表明荚膜唾液酸缺失后，病原菌对宿主上皮细胞和内皮细胞的黏附、入侵作用增强，而在宿主专职免疫细胞内的存活能力显著减弱，以上说明唾液酸对SS的致病性具有重要意义。

5 Cbp40

Cbp40是通过SS2菌株HA9801和T15进行抑制差减杂交试验证实的SS2的毒力基因［25］，与金黄色葡萄球菌的胶原结合蛋白Cna有共同的保守结构域。在斑马鱼感染模型中，Cbp40基因敲除株对HEP-2细胞的黏附、生物膜形成的能力及毒力都有所降低。通过基因表达的阵列评估SS2菌株ZY05719、Cbp40基因敲除株与小鼠脑微血管细胞的相互作用，发现在炎症和免疫反应，白细胞黏附和异嗜细胞黏附方面存在差异。Cbp40作为一种与宿主细胞黏附的细胞外基质蛋白，在感染过程中起着重要的作用。

6 VirA

Li P等［20］对野毒株ZY458进行了VirA基因缺失株458Deltavir和功能互补株458Deltavir（pVir）的构建，家兔动物试验结果显示，接种野毒菌株ZY458的家兔在感染6d内全部死亡，接种功能互补株458Deltavir（pVir）5只家兔中4只于感染6d内死亡，而接种VirA基因缺失株458Deltavir组家兔观察期无任何临床症状出现，体重增加正常，全部存活。此外，通过对野生型毒株和弱毒株的序列分析和对比，发现VirA基因只存在于强毒株中，因此该基因的功能可能与猪链球菌毒力有关，但其在猪链球菌中的致病机理仍不十分清楚。

7 pgdA

Fittipaldi N等［26］鉴定出SS2胞壁肽聚糖脱乙酰作用相关基因pgdA。体外试验表明，pgdA基因的缺失并没有导致SS2对溶菌酶敏感性的增加。pgdA基因缺失株在CD1小鼠和猪的感染模型中都呈现减毒趋势，毒力损伤主要由于血液中细菌含量减少。细胞试验中pgdA缺失株很容易被中性粒细胞杀灭，野毒株体外与中性粒细胞共培养过程中pgdA表达水平均上调，提示肽聚糖脱乙酰作用可能是SS2抵抗机体免疫系统的重要机制。

8 Trag

Trag是采用IVIAT（in vivo induced antigen technology）在SS2猪康复血清中通量筛选鉴定出的感染相关因子之一，参与细菌的分泌途径。Zhang H等［27］发现Trag基因存在于SS2的毒力菌株中，但不存在于无毒T15菌株中。Trag基因缺失株感染斑马鱼后毒力减弱，推测该基因的功能可能与SS2毒力有关，但其致病机理有待进一步研究。

9 溶血素相关基因

一个位于89kb毒力岛编码Ⅲ型溶血素相关蛋白［28］的基因Hhly3被发现，对其生物学特性研究发现，Hhly3基因缺失株的细胞溶解及溶血活性明显低于野生菌株。体外全血生长和斑马鱼动物试验中，缺失株的感染力和毒力均比野生菌株低。试验表明，除sly外，SS2还能编码另一种具有溶血活性的溶血素。

10 CiaRH二元调控系统

CiaRH是二元调控系统，广泛存在于细菌中，使生物体在感受并处理环境刺激时对基因表达做出调整。Li J等［29］构建了CiaRH缺失株，通过体外和体内试验对其毒力进行了测定。与野生株相比，缺失株对上皮细胞和猪髋动脉内皮细胞的黏附能力显著降低，然而巨噬细胞对SS的杀菌活性和体内血液对SS的清除力都有所增强。缺失株在CD1小鼠和猪体内毒力减弱，发病率和病死率都明显降低，试验结果表明，CiaRH与SS毒力有关。

11 分解代谢控制蛋白A

分解代谢控制蛋白A在其他链球菌属中具有调节免疫应答的作用，对SS毒力有显著影响。Willenborg J等［30］通过构建分解代谢控制蛋白A缺失株，得出在富含葡萄糖环境下分解代谢控制蛋白A是表达CPS所必须的，并推测分解代谢控制蛋白A可能也具有抵御吞噬细胞的杀伤作用。

12 金属结合脂蛋白A

金属结合脂蛋白A［31］是SS金属结合脂蛋白，需在低锰环境下生长，参与金属转运系统的组成，该种转运系统在细菌从宿主体内获取营养的过程中起着至关重要的作用，其基因缺失株对过氧化氢易感，小鼠感染金属结合脂蛋白A基因敲除株显示为无毒力表型，由此该基因可能与SS的生理生化特性及毒力有关。

目前SS没有发现可区分强毒株、弱毒株、无毒株的标志性毒力因子［32］，国内外针对SS毒力因子研究较流行的方法是基因敲除或突变法，由此鉴定出的基因元件可能并不是SS毒力因子，由于参与SS基础代谢的相关基因很多，缺失后会影响SS的生长，造成毒力降低或者消失的假象。SS毒力因子的组成十分复杂，各毒力因子的作用机理及其毒力因子之间的相互作用目前尚不清楚，有待进一步研究。综上所述，SS的毒力是由多种毒力因子协同作用的，对毒力因子的深入研究将有助于探究猪链球菌的致病机理，建立快速准确的诊断鉴定方法，对疫苗的研发也有着重要意义。

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