六种动物虫媒病病原检测方法研究进展

王 晶，王慧煜，贾广乐，胡永婷，韩雪清＊

（1.中国检验检疫科学研究院，北京100029；2.山西农业大学，山西太谷030800）

虫媒病是指通过吸血昆虫叮咬敏感的脊椎动物而在人、畜间传播的一类疾病。国际上已发现537种，其中140余种可引起人、畜疾病，表现为发热、皮疹、关节痛、出血热甚至病毒性脑炎等。在历史上曾使成千上万的人、畜患病或死亡，造成巨大的经济损失。随着全球气候的变化，现代化的交通工具使国际间的贸易、旅游交往日益频繁，为虫媒病的远距离传播和流行提供了更广泛的可能性。虫媒与虫媒性动物疫病的防控直接关系到我国人民身体健康、农业生产、生态环境及社会经济发展。蚊、蜱、蠓等虫媒通过飞机、轮船、陆地等边境口岸传入我国的风险非常高，虫媒传播的疫情也有可能随虫媒传入我国。其中最有代表性的，即非洲猪瘟（African swine fever，ASF）、西尼罗热（West Nile fever）、水疱性口炎（Vesicular stomatitis，VS）、蓝舌病（Blue tongue disease）、莱姆病（Lyme disease）和鹿流行性出血病（Epizootic hemorrhagic disease of deer，EHD），这些动物疫病近年来在周边国家的暴发流行已对我国形成威胁。因此，非常有必要开展虫媒性动物疫病病原检测方法的研究。

随着分子诊断技术的不断发展，一些分子检测方法如普通PCR、实时荧光定量PCR、多重PCR、环介导等温扩增（LAMP）技术等相继应用到动物虫媒病分子生物学检测中。特别是在20世纪80年代随着生物芯片技术的问世，人们对有效、快速、高通量的检测方法展开了大量的研究。虫媒基因芯片检测技术在多基因、微量化等诊断方面显示出了其较大的优势，为多种生物样本在同一平台上进行快速检测与鉴定提供了很好的技术支撑。

本文就近年在动物虫媒病的病原学、分子生物学检测方法以及基因芯片技术等方面的最新研究进展进行简要回顾，为进一步建立不同虫媒携带多种病原的高通量生物芯片筛查方法，并为我国边境口岸建立有效、快速的动物虫媒病分子生物学检测技术，提高我国在防范虫媒性外来动物疫病跨境传播的综合防控能力，有力保障我国畜牧业与卫生、社会、经济的健康发展提供参考。

1 虫媒病病原检测方法

1.1 西尼罗热

1.1.1 病原学 西尼罗热是由西尼罗病毒（West Nile virus，WNV）引起，主要由库蚊作为媒介进行传播的一种疾病。西尼罗病毒为单股正链RNA，属黄病毒科黄病毒属。该病毒因于1937年从乌干达的西尼罗地区一位发热妇女的血液中首次分离到而得名。病毒核酸编码3种结构蛋白和7种非结构蛋白，3种结构蛋白分别是病毒壳蛋白C、包膜蛋白（E）和前膜蛋白（prM）。E蛋白参与病毒与宿主细胞亲和、吸附及细胞融合过程，是病毒亲嗜性及毒力的主要决定蛋白。

1.1.2 分子诊断检测技术 陈晓等［1］针对E基因设计了一组引物及探针，建立了一步法实时定量PCR技术检测西尼罗病毒的方法。该方法对乙型脑炎病毒、亨德拉病毒、尼帕病毒和博尔纳病毒的检测结果为阴性，特异性好，其最低检出浓度为3.6×102拷贝/μL，具有较高敏感性。唐泰山等［2］以E基因和3′UTR非编码区，建立的 WNYC和 WNYA Taq Man探针的实时定量PCR法，具有高的敏感性和特异性，可以作为检测西尼罗病毒的技术储备。综合上述研究，E基因可作为设计引物和探针的靶基因，因为囊膜蛋白（E）的结构域上含有WNV特异性抗原表位［3］，可以将 WNV与相关的黄病毒进行鉴别。

1.2 水疱性口炎

1.2.1 病原学 水疱性口炎是由水疱性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus，VSV）所引起的人畜共患高度接触性传染的病毒性疾病。其主要的传播媒介是蚊媒，该病毒属于弹状病毒科水疱病毒属，分为2种血清型，即印第安型（IND）和新泽西型（NJ）。VSV为单股负链RNA病毒，共编码5种主要病毒蛋白，即糖蛋白（G）、基质蛋白（M）、核蛋白（N）、磷酸蛋白（NS）及病毒RNA聚合酶（L）。其中N蛋白具高度保守性，呈现群特异性，为所有型的VSV所共有，诱导产生非中和抗体，与其他弹状病毒无任何交叉反应，它在病毒RNA复制和转录调控中起着核心作用。

1.2.2 分子诊断检测技术 祁会彩等建立了一种能同时检测猪VSV等3种病原体的多重RT-PCR方法。该法以VSV的N基因保守区设计引物，待PCR扩增条件进行优化后，结果同时得到了3条特异性条带，且对猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）和猪传染性胃肠病毒（TGEV）核酸扩增结果为阴性，病毒RNA模板检出的最小量均为10fg。杨桂梅等选取VSV具有高度保守性的N基因序列设计引物，建立了VSV的RT-PCR快速检测方法。应用此法检测VSV-NJ株、VSVIND株均为阳性；而检测其他相关病毒性疾病的病毒如牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、蓝舌病病毒（BTV）等均为阴性结果，表明该方法具有良好的特异性。综合上述研究结果，在开展水疱性口炎病毒分子生物学检测技术研究中，选用具有高度保守性的N基因序列设计引物和探针，可达到既不漏检又不出现假阳性的目的。

1.3 非洲猪瘟

1.3.1 病原学 非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的猪的一种急性、热性、高度接触传染性疾病，由蜱媒传播，其临床症状表现为高热、皮肤充血、流产、水肿及脏器出血等，病死率高达100%，是我国一类动物疫病和世界动物卫生组织（Word Organisation for Animal Health，OIE）规定的必须报告的动物疫病。ASFV是双股DNA病毒，属非洲猪瘟病毒科，是目前惟一已知的代表种，编码至少34种结构蛋白。

1.3.2 分子诊断检测技术 曾少灵等［4］根据非洲猪瘟病毒结构蛋白基因vp73的序列，设计一对特异性检测引物，扩增片段251bp，建立了检测ASFV的PCR方法。与OIE推荐使用的2组PCR引物进行比对试验结果表明，研究设计的引物灵敏度至少高出100倍，并且特异性强。张泉用P72基因设计并合成引物以及荧光标记的Taq Man探针，建立了常规PCR和实时定量PCR检测方法，除了对含ASFV的P72基因的质粒PcDNAP72可产生特异性反应外，对其他猪病毒的cDNA或DNA都不能产生特异信号，具有很好的反应特异性。李洪利等［5］根据GenBank公布的23株编码结构蛋白P72的基因序列，设计引物和探针，建立了一套快速、灵敏、特异的检测非洲猪瘟病毒的实时定量PCR的检测方法。王彩霞等［6］以ASFV P72基因设计内外引物，建立了一种快速高效检测非洲猪瘟病毒的环介导等温扩增（LAMP）方法，同时进行了敏感性和特异性试验，其最低检测限为10拷贝质粒DNA，且具有良好的特异性。由于P72蛋白是ASFV的主要结构蛋白，高度保守，并且不同地区非洲猪瘟毒株P72基因在NCBI中同源性比较均在95%以上，因此在非洲猪瘟分子生物学检测方法的建立过程中，可选择P72基因作为靶基因设计引物和探针。

1.4 蓝舌病

1.4.1 病原学 蓝舌病是由蓝舌病病毒（Blue tongue disease virus，BTV）引起，由库蠓传播的一种出血性疾病，主要侵害绵羊或牛及部分鹿种群。该病毒属于呼肠病毒科环状病毒属。蓝舌病病毒由10个节段的双股RNA组成，编码7种结构蛋白（VP1-VP7）和4种非结构蛋白（NS1、NS2、NS3a和NS3b）。VP7携带有群特异性抗原决定簇，由病毒抗原决定簇产生的抗体多数是针对VP7的。NS1非结构蛋白由M5编码，尹惠琼对BTV不同血清型的保守基因VP7、NS1的碱基序列分析，发现NS1基因的5′端基因片段最为保守。

1.4.2 分子诊断检测技术 宋红梅等从感染BTV1的BHK-21细胞中提取RNA，以cDNA为模板对VP7基因进行PCR扩增，扩增的片段大约1 000bp，与预期大小1 050bp相符。尹惠琼等［7］选取NS1最保守基因片段设计引物及Taq Man探针，建立了BTV RT-PCR检测方法，用该体系对BTV-1、3、5、8、10、11、15、16、18、20、21、22 和EHDV-5进行检测，结果BTV各血清型标准毒株均呈阳性扩增曲线，EHDV-5为阴性，即可有效检出不同血清型BTV，与亲缘关系最近的EHDV无交叉反应，特异性好。综合上述研究，根据NS1最保守基因序列设计引物和探针，与OIE陆生动物手册推荐的诊断靶基因片段相同，以此来建立蓝舌病特异性的分子检测方法，可对不同血清型BTV进行通用检测。

1.5 莱姆病

1.5.1 病原学 莱姆病是媒介蜱传播的由伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi）引起的人兽共患病，其基本结构类似于细菌。与其他主要的细菌类群不同，隶属螺旋体科疏螺旋体属，其结构由表层、外膜、鞭毛、原生质4部分组成。外膜表面蛋白OspA、OspB、OspC等抗原具有高度免疫原性。其中OspA产生抗体持续时间长，与其他微生物的交叉反应性低，并具有良好的免疫原性。

1.5.2 分子诊断检测技术 付钰广［8］通过伯氏疏螺旋体16SrRNA基因序列，设计通用引物和探针，建立该序列的实时定量PCR检测方法，该方法可特异性的检测出阿氏疏螺旋体、伽氏疏螺旋体和狭义伯氏疏螺旋体，而与泰勒虫、巴贝斯虫、无浆体、衣原体和支原体病原无交叉反应，其敏感性为常规PCR的104倍，能从22.88fg的基因组DNA中检测到伯氏疏螺旋体核酸。牛庆丽等［9］设计伯氏疏螺旋体OspA基因片段的通用引物，获得1对特异性引物，优化反应条件后建立用于检测蜱体内伯氏疏螺旋体的PCR方法，该方法可检测出10pg的阿氏疏螺旋体、1pg的伽氏疏螺旋体和0.01pg的狭义伯氏疏螺旋体的3种不同基因型的伯氏疏螺旋体的OspA基因组DNA，表明其敏感性较好，适用于蜱感染伯氏疏螺旋体状况的调查。总之，在建立检测伯氏疏螺旋体的分子生物学方法中，对OspA基因设计引物是适合的，因为OspA存在于90%的莱姆病螺旋体，应用OspA基因设计引物均能检测出3种致病型，敏感性相比付钰广以16SrRNA基因序列建立的实时定量PCR更高，并且与其他微生物的交叉反应性低。

1.6 鹿流行性出血病

1.6.1 病原学 鹿流行性出血病（EHD）是由库蠓传播的鹿、绵羊等反刍动物的一种动物虫媒传染病。鹿流行性出血病病毒属呼肠病毒科环状病毒（EHDV）属，是双股RNA病毒，由10个片段组成，编码7个结构蛋白（VP1-VP7）和4个非结构蛋白（NS1、NS2、NS3a和 NS3b）。VP7蛋白是 EHDV的群特异性抗原，与BTV阳性血清没有交叉反应［10］。非结构蛋白基因相当保守，且与BTV相应片段有显著差异。其中NS3基因有群特异性，在EHDV-1和EHDV-2之间同源性为96.3%。

1.6.2 分子诊断检测技术 张彩虹等［11］选用NS3基因作为目标检测基因，建立了能同时检测并鉴别BTV和EHDV的二重LUXTM荧光PCR方法，该二重LUXTM荧光PCR的BTV和EHDV各自引物只对相应的病毒呈阳性反应，两者之间没有交叉反应，对其他几种相似疾病的病毒呈阴性反应。灵敏度分别为10个TCID50和1个TCID50。同时，与VP7基因作为靶基因建立的常规RT-PCR作比较，后者的灵敏度不及LUXTM荧光PCR方法。詹爱军等［12］对EHDV的VP7基因进行序列分析，设计EHDV特异性探针并用生物素标记，与荧光编码微球偶联后与病毒VP7基因的PCR产物杂交反应，建立了可检测EHDV的液相芯片快速检测技术，检测结果显示，该法具有较好的特异性，而与BTV的VP7基因、VSV的NP基因、WNV的E基因和AKV的N基因的PCR产物LQRR值都小于2，即不与其他虫媒病病毒反应，检测灵敏度为100个TCID50。上述研究表明，选择NS3基因设计引物和探针，可用于鹿流行性出血热病毒普通PCR鉴定、实时定量PCR和基因芯片的建立，尤其在高通量基因芯片技术的研究中，对探针特异性的严格要求，以NS3设计探针可以将同一个属的蓝舌病病毒鉴别出来。

2 虫媒病的基因芯片检测技术

生物芯片的概念来源于计算机芯片，借用了计算机芯片的集成化特点，将生物活性大分子或细胞等密集排列固定在固相载体上形成微型检测器件，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息，一次试验就可以对上万种基因进行快速、准确、高效的检测。自美国Affymetrix公司于1992年研制出第一张基因芯片开始，生物芯片就在生命科学领域迅速发展起来。目前生物芯片有着广泛的应用，包括疾病诊断和治疗、药物筛选、农作物的优育优选、司法鉴定、食品卫生监督、环境检测、国防、航天等领域。生物芯片种类主要分为基因芯片、蛋白芯片、组织芯片等，其中基因芯片是最早产生的一类芯片，也是现在使用最广泛的一类。

基因芯片在国外研究较成熟，应用范围也较广，其中在虫媒病毒的研究应用也逐渐发展起来。2006年，Fitzgibbon J E等［13］建立了正痘病毒和甲病毒的多重RT-PCR，并且PCR产物与基因芯片上的探针成功的进行了杂交，结果用包括委内瑞拉马脑炎、天花病毒等3种甲病毒和2种正痘病毒进行验证具有高度特异性。Grinev A等［14］开发了西尼罗病毒（WNV）DNA微阵列试验并进行优化，DNA微阵列包括263条寡核苷酸探针被有序的固定在氨基化修饰的载玻片上，能同时检测在WNV的整个结构区域的任何核苷酸突变，并且用2002年-2005年美国流行株的23个西尼罗病毒对该方法进行了验证。随后在2012年对来自2007年-2009年的11个WNV株也进行了验证［15］，结果检测寡核苷酸为基础的WNV阵列明确了所有突变的各结构区域，针对突变的WNV基因组所开发的芯片鉴定技术，可潜在地作为一种高通量、快速、有效的检测方法。Jack P J M等［16］利用寡核苷酸芯片技术检测识别可引起水疱样病变的18种家畜病毒，包括口蹄疫病毒血清型的代表，2种水疱性口炎病毒、猪水疱病病毒、猪水疱疹流感病毒、牛疱疹病毒Ⅰ、羊口疮病毒、伪牛痘病毒、蓝舌病病毒血清型Ⅰ和牛病毒性腹泻病毒Ⅰ，并成功鉴定到属的水平，表明进一步开发这种芯片分析可能是水疱样疾病诊断的重要途径。Baner J等［17］使用挂锁探针和基因芯片检测和鉴定口蹄疫病毒、猪水疱病病毒和水疱性口炎病毒，成功地检测和识别出不同地域的39个cDNA样本代表的3种病毒，结果与已确定的血清型完全一致。Houck J A等［18］开发了3种不同的芯片平台进行蜱中螺旋体的检测，结果显示可以同时检测和区分不同的疏螺旋体基因，至少能检测出疏螺旋体DNA的单一拷贝。Gardner S N等［19］利用SNP基因芯片技术对马脑炎病毒、正痘病毒、汉坦病毒等不同病毒的基因分型进行研究，及时跟踪病原毒株的疫情及变异，具有高通量、敏感性强等优点。同年，Berthet N等［20］建立了检测登革热病毒、西尼罗病毒、基孔肯雅病毒的重测序DNA微阵列（RMA）技术，从生物样品中提取病毒RNA进行RT-PCR，得到的DNA片段用于PID2-RMA杂交，结果显示具有很好的特异性，且灵敏度高，还可以有效的进行感染登革热病毒后的不同血清型的基因分析。

近年来，我国在虫媒病检测技术方面的研究步伐大大加快。詹爱军等［21］利用液相芯片技术建立了可同时检测鹿流行性出血热病毒、阿卡斑病毒、蓝舌病病毒和水疱性口炎病毒的快速高通量液相芯片技术，该方法具有较好的特异性，偶联特异性探针的微球只与相应的病毒基因的PCR产物反应，而不与其他虫媒病病毒反应，检测灵敏度达到50个～100个TCID50。罗渊等［22］在黄病毒属高度保守的NS5区设计属通用引物和种特异检测探针，成功建立了同时检测1～4型登革病毒、乙型脑炎病毒、西尼罗病毒、森林脑炎病毒和黄热病病毒等5种虫媒病毒的悬浮芯片检测方法。通过多批次的试验，变异系数均小于8%，表明该方法的特异性和稳定性均较好，对乙型脑炎病毒和黄热病病毒的检测敏感性可达到1.4个PFU，对西尼罗病毒可达14个PFU。朱晓光等［23］以甲病毒属的东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、辛德毕斯病毒和马雅罗病毒，黄病毒属的登革热病毒、西尼罗病毒、日本脑炎病毒和森林脑炎病毒，汉坦病毒属的汉坦病毒及布尼亚病毒属的布尼安亚病毒等13种主要虫媒病毒为研究对象，利用基因芯片技术，设计针对以上病毒的种及属水平的寡核苷酸探针，建立能对这些病毒进行属水平筛查及种水平鉴定的基因芯片技术，通过属和种水平的检测结果相互验证，为虫媒病毒的检测与鉴定提供一种高通量的新方法。郭欢欢等［24］根据乙型脑炎病毒的PrM和E基因序列的差异性，构建了乙型脑炎病毒分型基因芯片，用于乙型脑炎病毒的分型，具有检测乙型脑炎病毒和同步鉴别乙型脑炎病毒Ⅰ型和Ⅲ型的功能；张海燕等制备了乙型脑炎病毒与黄热病病毒联合诊断基因芯片，结果乙型脑炎病毒、黄热病病毒探针与相应的荧光标记样本杂交后，均能检测出阳性荧光信号，可应用于多病毒临床鉴别诊断。郑夔等［25］研究建立了1型～4型登革病毒、乙型脑炎病毒、西尼罗病毒和基孔肯雅病毒等7种毒株、1种黄热病毒疫苗株和1种裂谷热病毒的6种虫媒病毒微孔膜芯片检测方法，具有快速、准确、自动化和高通量等特点，为快速应对口岸输入性发热病例提供了非常有价值的检测手段。凡敏等［26］根据GenBank中收录的基孔肯亚病毒和辛德毕斯病毒基因的保守序列，合成2种病毒E基因序列及引物，设计针对2种病毒的寡核苷酸探针，初步建立了基孔肯亚病毒与辛德毕斯病毒特异性检测基因芯片技术。

3 小结

受全球气候变化及畜产品贸易的影响，虫媒病在全球逐渐蔓延呈现出向高纬度蔓延的流行趋势，部分动物虫媒病遗传特性发生改变导致病毒毒力改变、致病力增强、造成了严重的经济损失。只有从根源着手，阻断动物虫媒病的传播与蔓延，才能使人类免于虫媒病的危害。因此加强动物虫媒病病原基因的调查与监测，病原学基础研究具有重要意义。随着生物芯片技术的发展，基因芯片技术以其准确、高通量、快速、灵敏、特异、操作简便等显著优点成为一种极具吸引力的大规模生物检测平台，几乎可用于任何分子相互作用的检测。这为建立不同虫媒携带多种病原的高通量生物芯片筛查方法奠定了基础。也预示着该技术不仅在临床诊断、农业检测等领域大大推进，而且还将丰富兽医科学实验手段与基础研究进程。

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