猪博卡病毒研究概述

周宏专

（1.北京市农林科学院畜牧兽医研究所 畜禽疫病防控技术北京市重点实验室，北京100097；2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所矿物元素营养研究室，北京100193）

自2011年以来，国内很多猪场陆续暴发了腹泻性疾病，主要集中在产房哺乳仔猪，据有些发病猪场反映，哺乳仔猪病死率在70%以上，抗生素治疗和腹泻性疫苗免疫接种均未取得好的效果，疑似为新的传染性疾病；与此同时科研人员从腹泻仔猪的粪便中检测出一种新的病原—猪博卡病毒［1］。从分类上看，猪博卡病毒（Porcine bocavirus，PBoV）为细小病毒科、细小病毒亚科、博卡病毒属的成员，该属中还包括牛细小病毒（Bovine parvovirus，BPV）、犬细小病毒（Canine minute virus，MVC）、人博卡病毒（Human bocavirus，HBoV）等［2］。虽然此次国内哺乳仔猪腹泻的流行与PBoV是否有直接关系仍有待探讨，但其已经引起了极大的关注。由于PBoV的发现相对较晚，很多研究处于起步阶段，因此对该病原的全面认识将为下一步深入研究奠定基础。鉴于此，本文对PBoV国内外最新研究进展做一概述。

1 PBoV的发现

2009年，Blomstrom A L等［3］利用随机多重置换扩增方法（random multiple displacement amplification，MDA）在患仔猪断奶后多系统衰竭综合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）的猪淋巴结中扩增出了一段长1 879bp（FJ872544）的核苷酸序列，该段序列与已知病毒序列比较，发现其完整的NP1基因及部分VP1/VP2基因与人类博卡病毒相近，故将该病毒定名为猪博卡病毒（PBoV）。

2 基因组结构特征

PBoV为无囊膜单股线状DNA病毒，除具有细小病毒科其他成员同有的2个开放阅读框ORF1和ORF2外，其还有第3个博卡病毒特征性的开放阅读框ORF3［4］。ORF1编码病毒基因复制相关的非结构性蛋白NS1；ORF2编码2个结构蛋白，分别为衣壳蛋白VP1和VP2，其中VP1和VP2编码区重叠；ORF3编码高度磷酸化的非结构性蛋白NP1，其功能尚不清楚［2］。

截至2014年1月，GenBank中有完整PBoV基因组序列26条，接近完整的基因组序列3条，此外还有独立报道的NS1完整编码基因4条，NP完整编码基因12条，VP1/2完整编码基因2条。序列分析显示，PBoV基因组大小介于4 689bp～5 292bp之间，其中NS1编码基因介于1 731bp～2 412bp之间，NP编码基因介于657bp～693bp之间，VP1编码基因介于1 863bp～2 130bp之间，VP2编码基因介于1 635bp～1 716bp之间。

3 病毒分型

研究人员起初按照病毒发现时间的先后顺序，结合国际病毒分类委员会（International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV http：//www.ictvdb.org/）的分类标准，当NS1基因的核苷酸同源性低于95%时，即判为不同的基因型［2，5］。随着研究的不断深入，新的病毒序列不断被发现，研究人员对现有的序列进行梳理，通过对基因组序列，NS1/VP1/NP1基因序列遗传进化分析发现，猪博卡病毒属总能出现明显的3个聚簇，根据发现的先后顺序，研究人员将这些聚簇定为3个型，即PBoV1、PBoV2和 PBoV3［6-7］。

3.1 PBoV1型

最初在瑞士发现的PBoV-like（FJ872544，1 879bp）可以作为该型的代表序列［3］，在中国发现的 PBoV-SX （HQ223038）［8］、PBoV1-H18（HQ291308）［9］及 随 后 在 乌 干 达 发 现 的 Buk8-1（JX854557）也属于该型［10］。

3.2 PBoV2型

从中国健康猪粪便中获得的PBoV1-ZJD（HM053693）和PBoV2-ZJD （HM053694）可以作为该型的代表序列［5］，两者NS1基因的核苷酸同源性为94.2%。在中国发现的 PBoV2-A6（HQ291309）也属于该型，而其与 HM053693及HM053694NS1基因的核苷酸同源性分别为93.2%～94.2%，但研究者仍建议将三者归于同一型［6，9］。

3.3 PBoV3型

该型是最大的一个聚簇，该簇中包括从北爱尔兰、美国及中国获得的多个序列。3型序列间差异较大，同源性在76%～87.9%。研究人员建议按照VP1序列的特点将其分为A、B、C、D和E共5个亚簇［6，9］，认为 PBoV3-SH20F （JF429834）［11］、PBoV4-1-SH17 （ JF429835 ）［11］、 PBoV4-F41（JF512473）［12］、PBoV3C （JN681175）［6］及 PBoV5（JN831651）［13］可以分别作为 PBoV3A、PBoV3B、PBoV3C、PBoV3D 和 PBoV3E 的 代 表 序 列［7］。按照此划分，属于PBoV3A型的还有PBoV4-2-SH17 N-2 （JF429836）［11］、PBoV3-64-1 （JF512472）［12］及swBoV CH437（KF360033）［14］；属于 PBoV3B型的还 有 PBoV3-22/3 （JF713714/5）［9］及 PBoV4-1（JF429835.1）［11］；而 PBoV5 （JN621325） 属 于PBoV3E型［7］。然而，在具体划分时，利用全基因组序列，NS1、VP1或NP1序列分别划分所得到的亚簇结果可能不一致，这可能是由病毒在形成过程中的序列交叉重组所造成［11］；另外，有些序列不全，在分型时也不能准确归类，如PBoV-6V和7V，缺少NS1和NP1基因序列［5］。这些情况易造成新出现的博卡病毒命名混乱，因此命名时应该慎重并综合考虑［7］。

4 流行现状

瑞典学者Blomstrom A L等［3］采用PCR技术对34头PMWS病猪和24头健康猪进行了PBoV检测，结果在PMWS病猪中PBoV阳性率为88%，而健康猪群阳性率为46%，说明PBoV可能在PMWS致病作用中参与了共感染。随后，Cadar D等［15］于2006年-2007年和2010年-2011年采集了842头份野猪样品，经PCR检测共检出PBoV阳性109份，阳性率为12.94%，其中2006年-2007年阳性率为9.14%，而2010年-2011年阳性率为17.74%，显示出上升趋势。McKillen J等［12］对369份猪血清样品进行检测，PBoV3（JF512472，PBoV3A型）和PBoV4（JF512473，PBoV3C型）的阳性率分别为8.7%和9.5%，且发现的序列与传统序列不同。Jiang Y H等［16］对美国385份病猪的肺脏、淋巴结、血清和粪便样品进行检测其检测率为21.3%～50.8%，主要为PBoV1型及PBoV3A/3B/3C型，并发现同一样品中会含有多种基因型的PBoV。目前，PBoV除在欧洲、亚洲和美国能检测到之外，在非洲的乌干达和喀麦隆也能检测到猪博卡病毒序列［10，17］。

国内浙江、江西、安徽、河北、河南、江苏、北京、上海、新疆、山东、贵州、福建、广西、甘肃、湖北及湖南等多省市都开展了博卡病毒的相关检测工作。从检测的结果来看，有以下特点：①患病猪群的阳性率高于健康猪群。如Zhai S等［18］对2009年送检的191份疑似猪高热病病料的检测，结果检出PBoV（PBoV1型）阳性75份，阳性率为39.3%，表现呼吸道病症的断奶猪PBoV阳性率达69.7%，而其它猪群中阳性率为0%～13.6%。Li B等［19］对258份猪样品的检测，显示总阳性率为44.2%，且发病猪群的PBoV阳性率56.1%明显要高于健康猪群的阳性率16.7%。②国内PBoV序列种类多。如Zhang H B等［20］于2010年收集了中国10个省份的166份样品进行PBoV分型检测，结果PBoV1-4型的检测率分别为28.9%、6.6%、19.3%和39.7%，表明检测的4种基因型（PBoV2型及6V/7V未归类型）在我国都有发生。③不同地区检测的结果差异较大。如Lau S K等［11］从香港生猪屠宰场和养猪场的健康猪和病死猪中采集了333份样品，用PCR技术检出PBoV阳性55份，总阳性率为16.5%。Zeng S等［8］对来自湖北省的120份临床健康猪进行检测，结果显示PBoV1阳性率约为40%。Shan T等［9］对来自上海市、江苏省、安徽省、山东省和贵州省的猪粪便样品检测，其阳性率高达63.2%。胡军勇等［21］对湖北、湖南、河南省的79个规模化猪场采集的248份病料样品中有172份样品为PBoV阳性。Zhang Q等［22］年对985份腹泻样品检测时其阳性率达31.2%，且混合感染严重。④某些检测阳性率高于传统腹泻病毒。如焦洋等［23］对60份临床样品进行检测，显示PBoV 阳性率为21.7%，明显高于TEGV 和PEDV的阳性率（1.6%/6.7%）。

5 博卡病毒的检测方法

5.1 PCR检测法

作为实验室常用的分子水平检测方法之一，目前已有多篇关于PBoV检测的研究报道，设计的引物也针对不同基因。Zhai S等［18］首先根据报道的FJ872544（PBoV1型）序列，针对VP1/2编码区设计了一对扩增片段大小为496bp引物用于PBoV1型的检测；随后，Zhang H B等［20］根据不同序列特点，针 对 PBoV1（HM053693，PBoV2 型）、PBoV2（HM053694，PBoV2型）、6V（HM053672，序列不全未归类）及7V（HM053673，序列不全未归类）分别设计引物，扩增产物分别为430、428、517、527bp；胡军勇等［21］根据报道的HM053693及HM053694序列，针对NS1编码区设计了1对扩增片段大小为482bp的简并引物用于PBoV2型相关样品的检测。为了获得更多的博卡病毒新序列，Lau S K等［11］在对HBoV、BPV及MVC的NS1编码基因比对分析的基础上，设计了简并引物，其扩增产物长度为144bp，结合来自于VP1编码基因的特异性引物对用于博卡病毒的检测。随着研究的深入，博卡病毒的基因型越来越多，准确对其检测也成了一个难题，因此，蔡雨函等［24］分别设计出扩增 PBoV1/PBoV2（扩增产物418bp，PBoV2型）及 PBoV3/PBoV4/PBoV5（扩增产物215bp，PBoV3型）的简并引物，并通过对两组引物的比例、退火温度等条件的优化，首次建立了同时检测PBoV1/PBoV2和PBoV3/PBoV4/PBoV5的双重PCR方法。除此之外，焦洋等［23］还建立了 TGEV、PEDV和PBoV多重PCR检测方法。

5.2 实时荧光定量PCR检测法

Li B 等［19］根 据 GU902967-GU902971、HQ223038及FJ872544的NP1序列（PBoV1型）保守区设计引物和Taq Man探针建立了实时荧光定量PCR检测方法，其敏感性、重复性和特异性较好。邓波等［25］则根据报道的 FJ872544（PBoV1型）序列，通过VP1/2基因设计引物和Taq Man探针建立了实时荧光定量PCR检测方法，具有很好的灵敏性和特异性。

5.3 LAMP检测法

Li B等［26］报道以 VP1/2基因序列（PBoV1型）为基础，建立了一种PBoV的环介导等温扩增（loopmediated isothermal amplification，LAMP）技术检测方法，所建立的方法高度特异，与PRRSV、PCV2、PPV和CSFV无交叉反应，最低可检测10个拷贝，敏感性是传统PCR方法的100倍。

5.4 ELISA 检测法

McNair I等［27］报道用细胞培养分离的PBoV制备单克隆抗体，并选取了其中的2株IgG2a亚型单抗建立了检测抗原的ELISA方法。作者指出，所制备的单克隆抗体非常特异，选取的PBoV3（JF512472，PBoV3A 型）mAb不 能 用 来 检 测PBoV4（JF512473，PBoV3C型），反之亦然。

6 其他相关研究

李彬等［28-29］分别对PBoV的NP1基因和VP2基因进行了原核克隆表达，为研究相关蛋白的功能及建立相应的血清学诊断方法奠定了基础。杨晚竹等［30］利用半套式PCR方法在健康猪粪便标本中筛查出2株PBoV环状附加体PBoV-G2-episome和PBoV-G3-episome。通过测序和拼接得到其末端非编码区序列（405nt和511nt）。经过分析及二级结构预测，发现PBoV-G2-episome与人博卡病毒3附加体（HBoV3-episome）结构相似，而PBoV-G3-episome与博卡病毒属其他成员的末端二级结构存在较大差别。该研究表明某些博卡病毒与其他细小病毒的复制方式存在一定差异，也为今后博卡病毒感染性克隆的构建提供了一个思路。

总之，随着研究的不断深入，对PBoV在病原学，流行病学及诊断方法方面的认识逐渐加深。然而对于病毒体外培养体系的建立，目前仅有1篇相关报道［12］。此外，PBoV的基因型分型、感染性克隆研究、致病机理及动物模型的建立等方面的研究薄弱，这也将会是今后研究的重点方向。作为同为博卡病毒属的HBoV，研究者已开展了相关蛋白自身结构［31］及其在病毒复制［32］、细胞阻滞及凋亡［33-34］、调节宿主免疫实现免疫逃逸［35-37］和病毒对于其他病毒免疫应答系统的调节作用［38］等方面的基础研究，这些研究也可为进一步探索PBoV的感染致病机制及免疫防控提供借鉴。

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