磁性微球在细胞与生物大分子分离纯化中的应用

崔梦楠，田 伟，马素娟，李明生，马忠仁，冯玉萍＊

（1.甘肃省动物细胞工程技术研究中心，甘肃兰州730030；2.西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州730030；3.兰州理工大学生命科学与工程学院，甘肃兰州730050）

磁分离技术是以具有超顺磁性的磁性微球为固相载体，通过表面功能基团特异性吸附及解吸附，在外加磁场作用下分离目标产物的一种新型分离技术［1］。在磁场条件下，磁性微球能够稳定的悬浮在溶液体系中，其超顺磁性能够快速的使固液分离，而省去传统分离中离心过滤等繁琐操作，同时还可以提高分离过程中反应物之间相互作用的动力学速度。另外，磁性微球由于比表面积大，表面可偶联的配基容量也大，因而通过共聚、球表面改性后可赋予多种活性功能基团（-COOH、-COH、-NH2等），快速且特异地结合酶、细胞、抗体等生物活性物质［2］。因此，磁分离技术在生物分离纯化领域有着广阔的研究和应用前景。

磁分离技术在生物分离领域中的应用首先由Robinson P J等［3］提出，将纤维素磁性微球用于酶的固定化。随后的20年，磁性微球在生物分离领域的应用发展缓慢。进入21世纪后，磁分离技术开始迅速发展，并在Ugelstad J等［4］研究基础上相继开发了一系列的商品化产品Dynabeads。目前磁分离技术己经在细胞分类和分离、蛋白提纯、核酸分离、细菌和病毒分离及免疫检测等诸多方面展现出重要的应用价值。

磁分离技术发展至今仍然面临很多问题。磁性微球自身缺陷及分离条件和环境都对生物大分子物质的分离纯化有着至关重要的影响。理想的磁性微球是磁分离技术的基础，稳定的分离环境是保证磁分离高效进行的必要条件。理想的磁性微球需要具备足够大的比表面积，表面配基的连接也要均匀，这样才能够保证对产物有高效的吸附率。因此，制备适应不同要求的磁性微球已经成为研究的热点。本文从磁性微球结构特点出发，分析其基本原理，简单阐述磁性微球在细胞、蛋白质及核酸等分离纯化中的现状，并对其在各部分的应用趋势进行总结。

1 磁性微球的结构性质和分离原理

1.1 磁性微球的结构和性质

磁性微球是通过适当的理化方法将无机磁性材料和有机高分子材料结合而形成的一种多功能复合材料。根据球芯和外壳材料的磁性特点可分为磁性核或磁性壳型，混合型和多层型。无机磁性材料主要有金属 （Fe、Co、Ni）、铁 氧 体 （MeO·Fe2O3、Fe3O4）、合金（FeCo）、铁酸盐等，其中Fe3O4由于磁性能好，制作工艺简单，成本低，而成为应用最广泛的磁核。高分子材料有天然与合成两类。天然高分子材料主要有琼脂糖、淀粉、明胶、纤维素、壳聚糖等；合成高分子材料主要有聚苯乙烯、聚苯乙烯醇等。

目前磁性微球的制备方法主要有磁性粒子单体聚合法、磁性粒子聚合物组合法和磁性粒子聚合物原位生成法。磁性粒子聚合物组合法制备磁性微球方法简单，但制备出的磁性微球单分散性差，形貌不规则。磁性粒子单体聚合法主要是以高分子单体聚合的方法为主，相对磁性粒子聚合物组合法要复杂，制备出的磁性微球分布较宽、粒径较大或包埋磁性粒子效果差，使得后期应用受到限制［5］。通过不同的制备方法可得到性能不同的磁性微球，再加上表面功能基团的修饰，使得磁性微球几乎可以偶联大部分生物活性物质。应用于生物磁分离技术中的磁性微球应具有合适的磁响应度、均一的粒径分布、良好的生物相容性、稳定的特异吸附表面等特性［6］。

1.2 磁性微球的分离原理

磁分离技术的分离有2种方式，即直接分离法和间接分离法。直接分离法是指磁性微球表面连接的是能够特异性结合目标产物的基团，在溶液体系中特异性结合目标产物，在磁场作用下与其他物质分离。间接分离法是在分离前先对目标产物进行处理（例如抗原纯化中，首先将抗原与第一抗体连接），使其能够与磁性微球表面的基团（第二抗体）结合，在磁场作用下将携带目标产物的复合物分离出来，再借助其他手段解吸附目标产物。

2 磁性微球在细胞分选中的应用

磁性微球在细胞分离中的应用主要分为2类［7］，即非特异性吸附和特异性吸附。磁性微球具有较大的比表面积，并且有较强的极性。正常生理条件下细胞通常也是带电的。磁性微球和细胞之间可以通过静电引力结合。这类吸附一般没有选择性，所以称之为非特异性吸附。而特异性吸附则是磁性微球表面偶联某种细胞能够特异性结合的物质，通过特异性吸附分离细胞。这类分离方法更加精确。所以，特异性吸附成为磁性微球在分离细胞中应用的主要方法。

Molday R S等［8］首先提出用磁性微球来分离细胞，用荧光染料标记含羧基的磁性微球，再用碳二亚胺活化，在其表面偶联外源凝集素或抗体，成功地分离了B淋巴细胞和人血红细胞。近年来，Haik Y等［9］采用特异性磁分离技术提取血红细胞，结果显示仅有0.85%的血红细胞残留，很大程度上提高了人血红细胞的分离效率。Ting H C等［10］制备了连接抗生物素蛋白的聚苯乙烯-甲基丙烯酸缩水甘油酯微球，特异性吸附了骨髓干细胞表面抗原-1（Sca-1）细胞。Modak N等［11］则将磁分离技术和微流控技术相结合用于细胞分离，为研制磁性微球介导的微流体细胞分离系统提供了重要参数。还有研究者［12］通过磁分离技术特异性识别微藻类细胞，从而快速从溶液体系中捕获微藻类植物。另外，磁性分离技术在原核细胞（如细菌细胞）分离中的应用也有报道［13］。

目前，磁性微球在细胞分选中的应用主要是以德国Meltenyi公司研发的免疫磁性细胞分选技术为标准［14］，其主要成分包括 MACS微珠、MACS分选柱和MACS分选器。MACS微珠是偶联高度特异性单克隆抗体的超顺磁性微球。首先把细胞用MACS微珠特异性标记，然后使这些细胞通过一个放在强而稳定磁场中的MACS分选柱，被磁性标记的细胞滞留在柱里，而未被标记的细胞则流出。当分选柱移出磁场后，滞留柱内的磁性标记细胞就可以被洗脱出来，这样就完全可以获得标记和未标记的2个细胞组分，得到的细胞可立即用于后续试验。

Kuana W C等［15］利用带有特定氨基的磁性单分散聚合微球成功的从人癌细胞系中分离到CD133阳性细胞，其对癌症的诊断具有重要意义。在癌症治疗过程中，化疗前将骨髓抽出，采用细胞磁免疫分离方法，将肿瘤细胞和正常细胞分离，将肿瘤细胞杀死后再将正常细胞注入患者体内，在很大程度上减少了病人的痛苦，减少了放射性治疗对病人身体的伤害。这在临床上有相当重要的实际意义。未来几年这仍将是磁性微球在细胞分选中应用的研究重点之一。

3 磁性微球在核酸分离中的应用

磁性微球在核酸分离中的应用能够克服传统核酸分离方法步骤繁琐、收率低、接触有毒试剂、实现自动化困难等缺陷，是未来核酸纯化技术发展的一个重要方向。磁性微球在核酸分离中的应用首先由Hawkins T L等［16］于1997年提出，随后开始快速发展。有研究者［17］将磁性明胶微球分离提取法和传统氯仿提取法进行了对比研究，结果发现磁性微球分离法获得了大约2倍数量的DNA，并且DNA质量也优于传统氯仿提取法。大肠埃希菌中核酸的分离也可以借助磁分离技术来实现。Ma C等［18］制备了四氧化三铁和二氧化硅的单分散复合微球，并将其成功用于大肠埃希菌中核酸的分离。2012年，Percin I等［19］通过乳液聚合法制备聚羟乙基甲基丙烯酸磁性复合纳米微球，非特异性分离大肠埃希菌溶菌液中的质粒DNA，结果表明该磁性纳米微球使用6次后对质粒DNA仍具有高选择性，质粒DNA的最终回收率可达92%。另外，王爱迪等［20］将磁性微球提取基因组核酸方法与实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）相结合，成功建立了食品中转基因成分的快速检测新方法。

磁性微球在核酸分离中的应用大大提高了核酸的分离效率，同时也为核酸分离的自动化提供了技术支撑。基于磁性分离的全自动核酸分离系统是近年来发展起来的一种新型技术。目前，已有不少公司致力于全自动磁分离核酸分离系统的开发，并取得了较好的进展。其中罗氏公司的最新产品Mag-NA Pure LC 2.0可从各种不同的样品（如动植物组织、血液、细胞、体液、食品等）中分离纯化出高纯度的（脱氧）核糖核酸。中国台湾圆点纳米技术开发有限公司的Smart LabAssist全自动磁珠核酸提取仪基于磁棒架上的磁棒吸附磁珠，将磁珠移至不同的试剂槽内，可同时处理32个样品。科华生物的核酸提取仪采用磁珠法，实现批量化，可同时处理93个样品，自动化操作，省时省力［21］。

目前，核酸的全自动化提取仍然处在萌芽阶段，这是核酸提取技术发展的必然趋势，也是磁分离技术在核酸分离领域应用研究的重点方向。在全自动化核酸分离目标实现的过程中需要不断地去改进究磁性微球自身的特性。

4 磁性微球在蛋白质提纯中的应用

磁性微球在生物分离纯化中的应用大多都集中在细胞和核酸的分离上。随着蛋白质组学的快速发展，磁性微球在蛋白质分离纯化中的应用也得到了快速发展。它是通过在微球表面修饰的功能基团能与靶向蛋白可逆结合，从而达到靶蛋白分离的目的。与传统分离方法相比有纯度高、速度快、回收率高的优点。

4.1 磁性微球在蛋白质分离中的应用

磁性微球在蛋白质分离中的应用主要集中于常规实验室蛋白分离，如酶蛋白、抗体蛋白、重组蛋白等。Shao M F等［22］制备了由四氧化三铁/二氧化硅/镍铝层状氢氧化合物组成的三维核壳磁性微球，并将其用于重组蛋白纯化中，结果表明微球上的Ni2＋对-His重组蛋白表现出较高的吸附率（239μg/mg）并能持续几个纯化周期。Li Z H等［23］利用染料配基（活性红120）偶联壳聚糖磁性微球从蛋清溶液中特异性吸附溶菌酶，循环使用4次后吸附率仍能达到92.6%，最终提取的溶菌酶纯度达80.7%，回收率89.1%。Vijaykumar L D 等［24］将氨基苯硼酸磁性微球用于抗体分子的纯化，通过磁性微球表面的氨基与抗体偶联，每克磁球可结合170mg±10mg并能能洗脱回收160mg±5mg的人IgG；当直接从CHO细胞上清中纯化时，98%的IgG可结合，其中95%可有效回收，最终纯度达到98%以上。

4.2 磁分离技术和其他技术结合在蛋白质分离中的应用

随着磁分离技术的发展，许多研究者将磁分离技术与分子印迹或双水相萃取相结合应用于蛋白质分离纯化中。分子印迹聚合物包裹磁性粒子可形成表面具有分子印迹的磁性材料，通过印迹位点、形状、官能团的互补作用达到分离蛋白质的目的［25］。该方法操作简单，选择性高抗。Tan C J等［26］提出一种共价固定模板蛋白表面印迹法，利用乳液聚合法制备了表面共价结合模板蛋白（牛血清白蛋白）的印迹亚微米磁性粒子，该粒子内包纳米磁性粒子，有很强的超顺磁性，在水溶液中对模板蛋白具有非常好的识别性能。由于模板蛋白固定对蛋白质的成功印迹是十分重要的，因此该方法将有望成为一种普适性蛋白质印迹法。另外，在双水相体系中，亲水性蛋白通常在表面活性剂较少的相中的分配系数较大，当磁性吸附剂（磁性微球）引入双水相后，吸附目标蛋白，使其从表面活性剂较少的相进入富含表面活性剂的相，可加速相分离，提高生产能力［27］。Becker J S等［28］将磁性吸附剂和双水相体系结合，从溶菌酶和卵清蛋白混合体系中纯化亲水性蛋白溶菌酶，结果显示溶菌酶最终回收产率达74%，纯度超过80%。该方法可用于亲水性蛋白的分离。

4.3 磁性微球分离蛋白质的发展趋势

磁性微球在蛋白质分离纯化领域的应用主要依赖于吸附容量高、选择性好、可重复使用、价格便宜的磁性微球的制备。因此，应用于蛋白质分离纯化领域的理想磁性微球的制备将是未来的发展趋势之一。另外，随着智能高分子材料的快速发展［25］，将磁性微球与对外界环境（如温度、pH、离子强度、光等）敏感的智能高分子材料相结合，合成智能型磁性微粒并将其用于蛋白质的分离纯化中也将是未来的发展方向之一。

5 展望

近年来，磁性微球分离技术用于生物分离纯化简便而备受关注，随着磁性微球的制备技术逐渐成熟，磁分离技术已经由实验室走向实际应用生产：①磁性微球分离法整体过程缓和，确保活性成分结构完整保留；②分离纯化步骤简单，所有反应可在一个试管中完成；③无需昂贵的大型设备，比如离心机、色谱系统和超滤装置等；④简便快速洗脱、产物浓度高；⑤磁分离技术很容易实现分离分析的自动化。此外，目前国外已有相关产品，但是价格昂贵。国内在此方面研究仍处于实验性阶段，依然存在诸多问题需改善：①磁性微球制备方法的深入研究，不同的方法从根本上影响着磁性微球在纯化过程中性能的稳定性；②磁性微球表面修饰的多样化也决定着纯化的效果和速度；③反复利用效果也是磁性微球现存的问题之一。未来，磁性微球分离技术在生物分离纯化中很有可能取代现有的纯化技术，成为生物纯化技术的主要趋势。

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