大肠埃希菌毒力基因研究进展

张金宝，李晓娜，王桂琴

（宁夏大学农学院，宁夏银川750021）

大肠埃希菌是澳大利亚医学家Escherich在1885年借助显微镜首次发现的。在相当长的一段时间内，一直被当作是正常肠道菌群的组成部分，认为是非致病菌。直到20世纪中叶，学者们才逐渐认识到一些特殊血清型的大肠埃希菌对人和动物有致病性，尤其对婴儿和幼畜，常引起严重腹泻和败血症［1］。并引起患病畜禽生长发育迟缓，生产能力低下，甚至造成死亡，给养殖业带来严重的损失。大多数菌株具有运动性，属于人和动物体内的共生菌，也是条件性致病菌，是重要的且数量最多的肠道菌群成员之一，主要寄居于人和动物的肠道内［2］。致病性大肠埃希菌也是引起许多肠内、肠外疾病的主要原因，并可以通过食物、水源等方式传播，从而暴发疫情［3］。

目前，在养殖业中各种药物的滥用导致病原微生物的耐药性，已经给疾病的防控带来了新的严重的问题，目前出现了一种细菌耐多种药物的情况。如何减少细菌耐药性，已经成为世人关注的话题。着眼于目前的实际情况，新兽药的研发和合理用药是解决目前问题的关键。截止目前，人们也只是了解部分大肠埃希菌毒力基因，加之近些年大肠埃希菌耐药现象的出现及不同血清型的菌株毒力之间也有差别，使得毒力基因和耐药性之间的研究尤为重要。因此，了解大肠埃希菌毒力基因、耐药性及其它们之间的关系是解决致病性大肠埃希菌感染问题的关键因素之一。

1 大肠埃希菌毒力基因

大肠埃希菌是人和动物体内的共生菌，也是条件性致病菌，甚至威胁到宿主机体生命健康。目前，致病性大肠埃希菌的毒力因子主要分为黏附素和毒素。最初致病性大肠埃希菌是根据其临床症状而命名的，例如致泻性大肠埃希菌、致肾盂肾炎大肠埃希菌、致新生儿脑膜炎大肠埃希菌 、败血性大肠埃希菌等。后来根据血清型将其分为K、O、H抗原型大肠埃希菌。

如今，根据致病性大肠埃希菌的致病特性将其分为3个主要亚群，即共栖菌或非致病性大肠埃希菌、引起肠道感染的致病性大肠埃希菌和肠外致病性大肠埃希菌（Extraintestinal pathogenic E.coli，ExPEC）。肠道致病性大肠埃希菌亚群涉及多种病型如肠致病性大肠埃希菌（Enteropathogenic E.coli，EPEC）、产志贺毒素大肠埃希菌（Shiga toxin-producing E.coli，STEC）、产肠毒素大肠埃希菌（Enterotoxigenic E.coli，ETEC）、肠聚集性大肠埃希菌（Enteroaggregative E.coli，EAEC）、肠出血性大肠埃希菌（Enterohemorrhagic E.coli，EHEC）、侵袭性大肠埃希菌（Enteroinvasive invasive E.coli，EIEC）等［4］。

在EPEC中具有一个肠细胞脱落位点（locus of enterocyte effacement，LEE）毒力岛，其含有seps、escs、ces、ler、Tir、eaeA、EspA、EspB、EspD等基因；EHEC包含有Stx、Stx1、Stx2、Stx2c、Stx2d、Stx2e、hlyA、hlyE、hlyF等；EAEC毒力基因和致病因子有aggR、aggA、aafA、astA、agg3、aatA、pet、aap 等；ETEC包含的基因有ST（STa、STb）、LT等。论文主要介绍eaeA、Stx2e、ST（STa、STb）和astA 4个毒力基因。

1.1 eaeA基因

肠致病性大肠埃希菌（EPEC）菌株的毒力基因岛和小基因簇容易引起急性胃肠炎。在发展中国家，EPEC是引起婴儿腹泻的显著原因，这与它的高病死率（10%～40%）相关联［5］。

在EPEC中具有一个肠细胞脱落位点（LEE）毒力岛。LEE是细菌染色体上编码毒力相关基因，大小为35kb的特殊区域［6］，G＋C%含量为38.36%，这比大肠埃希菌全基因组G＋C%含量50.8%要低得多，它所编码的毒力因子是引起肠黏膜黏附与脱落损伤所必需的。所含有的基因主要有sep、esp和eaeA基因。最初被发现的基因是eaeA基因，一种分子量为94ku～97ku称为紧密黏附素的细菌外膜蛋白，介导细菌紧密黏附在宿主肠上皮细胞上。eaeA基因位于LEE致病岛上的第22个开放性阅读框，即ORF22。LEE毒力岛中的eaeA基因编码eaeA基因的5′端及中间区域约2/3在不同细菌和不同菌株间高度保守，而3′端变异较大。

1990年，Jerse最先用TnphoA突变体的方法克隆鉴定并报道了eaeA基因。所有导致黏附脱落（attaching and effacing，A/E）损伤的猪源大肠埃希菌都有LEE毒力岛 。在一些研究中表明eaeA阳性的非典型肠道致病性大肠埃希菌菌株是最常见的，占到73%。还有试验证明在非典型肠道致病性大肠埃希菌菌株中eaeA阳性率大于典型肠道致病性大肠埃希菌菌株［7］。引起 A/E损伤的所有基因都位于大肠埃希菌基因组被称为肠细胞脱落位点（LEE），这些基因主要包括编码Ⅲ型分泌系统（esc或sep），分泌型蛋白质（esp）及其分子伴侣；紧密素易位受体（tir）和外膜蛋白紧密素（eaeA）等基因，最主要的一个基因就是eaeA基因［8］。LEE在猪源大肠埃希菌中的存在是某些猪场引起仔猪腹泻的原因之一。

1.2 Stx2e基因

肠出血性大肠埃希菌（EHEC）通常通过进食生的或未熟的肉类、生牛奶或者生食被污染的蔬菜水果而发病，其主要通过黏附素在消化道定殖，产生志贺样毒素（Shiga toxin，Stx）。志贺毒素基因是一个新兴的致病基因，可引起人的出血性结肠炎-溶血性尿毒综合征（Hemorrhagic colitis and hemolytic uremic syndrome，HUS）、腹泻和猪水肿病的重要致病因子［9］。

Stx基因又名Vero细胞毒素（Vero toxin，VT），是由A、B两个亚单位组成的A-5B模式的复合毒素。A亚单位具有细胞内毒性，能与28S rRNA作用从而抑制蛋白质的合成，是EHEC引起临床表现的病理基础；B亚单位是无毒的，具有细胞结合特性，能与具有特定糖鞘脂受体（Gb3）的细胞结合，而引起A亚单位发挥作用。志贺样毒素是一种决定EHEC特性的最为重要的毒力因子，主要血清型是O157∶H7。感染后出现感染性腹泻、出血性结肠炎，还可在5%～10%的病例中引起溶血性尿毒综合征及血栓性血小板减少性紫癜等严重并发症，严重者可引起死亡［10］。其按照抗原性和免疫原性的不同，分为Stx1和Stx2，分别编码1型与2型志贺毒素且抑制哺乳动物的蛋白质合成［11-13］。Stx2的突变体有Stx2c、Stx2d、Stx2e和Stx2f等至少12种变种类型［14］，其中产志贺样毒素大肠埃希菌（Shiga toxin-producing Escherichia coli，STEC）为猪水肿病的病原，而STEC产生的Ⅱ型志贺毒素变异体e亚型（Shiga toxin 2e，Stx2e）是重要的致病因子，又叫猪水肿病毒素，与Stx2基因序列的同源性在90%左右［15-16］。来自人和牛的Stx2主要与Gb3受体结合，B亚基的64、66位氨基酸与Gb3、Gb4的结合力有关。大肠埃希菌O157：H7可产生Stx1和Stx2两种类型的毒素，均与Vero细胞表面Gb3受体结合［17］。因此，O157：H7产生的Stx毒素对Vero细胞存在很强的细胞毒性。

Stx2e毒素所引起的人类疾病不断被报道，据统计从患病人体内已经分离到了472种血清型的STEC。在众多产志贺毒素大肠埃希菌中，最为人们熟知的是大肠埃希菌O157：H7，而其他较不常见的致病菌株，亦可引起严重疾病。2011年5月，在德国一个较为罕见的产志贺毒素的血清型（O104：H4）引起腹泻和溶血性尿毒症的暴发，疫情造成数千人感染，至少34人死亡［18］。Oanh T K N 等［19］报道用Stx2e毒素A亚基的双突变株（Y77S，E167Q）无论是直接免疫仔猪还是预先免疫母猪都能对ED起到很好预防作用。

在有些情况下，禁止使用某种化学物质会导致其他化学物质使用量激增，破坏减排计划。例如，法国的小麦种植者依靠包裹在种子上的新烟碱类物质来保护植株不受蚜虫和叶蝉的侵害，现在这类杀虫剂被禁用，一些种植者可能会增加其他杀虫剂的使用。另外还有其他的利弊权衡，一些专家担心，禁用除草剂草甘膦，农民就得在土壤中除草，可能会导致水土流失或增加温室气体排放。芬格认为，“迫切需要”对这种利害关系权衡进行更多的研究。

1.3 ST 基因

产肠毒素大肠埃希菌（Enterotoxigenic E.coli，ETEC）是引起幼畜禽腹泻甚至死亡的主要病原菌。据估计，因ETEC引起的新生幼畜腹泻发病率高达30%～50%，病死率达10%～30%。国内约有35%的仔猪腹泻是由ETEC引起的，而在美国等国家，由ETEC引起的新生仔猪腹泻占45%以上，给畜牧业造成巨大损失［20］，最早流行于20世纪60年代晚期。其具有两类致病因子，一类为黏附素（或称定植因子），另一类为肠毒素。ETEC产生两种肠毒素，一种为耐热性肠毒素（heat stable toxin，ST），在100℃30min基本不失活；另一种为不耐热性肠毒素（LT），在65℃30min即完全失活。ST分子质量较低（＜9ku），无抗原性，成熟的ST为18或19个氨基酸组成的小肽，有很强的毒素活性，而免疫原性极差。根据ST的生物学特性及致病性，将其分为STa和STb两类。

STa是一种小分子质量蛋白（约2ku），由18个氨基酸（STap，猪源或人源）或19个氨基酸（STah，人源）构成，具有3个链内二硫键［21］。其含有13个高度保守的氨基酸序列（5～17氨基酸），这段氨基酸小肽保留了STa的完全毒性，为一个毒性区，它具有与天然毒素相似的受体蛋白结合能力。可溶于甲醇，可引起乳鼠和乳猪肠积水。STa在导致腹泻的ETEC分离株中的检出率很高，STa的阳性率为75%，STb的检出率约为90%；在流行病学上起着重要作用，两者都激活鸟苷酸环化酶，使细胞内cGMP水平升高，扰乱电介质代谢，引起腹泻［22］。

STb发现的相对较晚，因此关于它的研究相对滞后于STa。一些研究者发现在引起断奶仔猪腹泻的ETEC分离株中，STb的检出率非常高，与断奶仔猪腹泻密切相关，因而引起研究者的广泛关注。STb是一种由48个氨基酸组成的蛋白质，分子质量约为5ku，多肽分子的前体为71个氨基酸，分子质量8.1ku；成熟STb分子含有4个半胧氨酸（cys）残基，可以形成2个分子内的二硫键［21］，分别位于cys-10和cys-48之间以及Cys-21和Cys-36之间。STb不溶于甲醇，对乳鼠不引起肠积水，而对断乳小猪可致肠积水。

目前，全世界人类疾病预防方面使用ETEC疫苗中都没有包括ST成分，在我国动物疾病预防方面用ETEC疫苗中也很少见有使用STa或STb的报道。对于这种状况，国内外研究者为了获得STa与STb的类毒素，将其两者与多种蛋白质进行化学偶联或用基因工程手段构建融合蛋白—“ST-载体”。

1.4 astA基因

肠聚集性大肠埃希菌（Enteroaggregative E.coli，EAEC）是婴幼儿及幼畜禽持续性腹泻的病原。于1987年，在智利的一位患持续性腹泻的儿童粪便中分离得到，该菌在组织培养中以特有的“砖块样”或“聚集样”的形式黏附在上皮细胞株 HEp-2上，被命名为肠聚集性大肠埃希菌（EAEC或EaggEC）［23］。其对动物及人的肠黏膜能发生特征性黏附，对人小肠下段及结肠黏膜的黏附最强，对人、牛等红细胞发生抗D-甘露糖的血凝。经研究调查显示，发达国家EAEC感染引起腹泻约为4%，而在发展中国家EAEC感染引起腹泻的发病率达到15%。

近年研究的EAEC毒力基因和致病因子有aggR、aggA、aafA、astA 等［24］。EAEC 毒 素 基 因 有3种，即质粒编码毒素（pet）、EAEC耐热肠毒素（EAST1）、志贺菌肠毒素（SHET1）。其中肠毒素astA基因是编码肠聚集性耐热毒素，与大肠埃希菌Sta肠毒素基因有类似的性质。astA是耐热蛋白，与ETEC产生的肠凝集性大肠埃希菌耐热肠毒素Ⅰ（EAST1）功能相同。最初这种毒素只是从EAEC菌株中检出，随后在 ETEC、EHEC、EPEC 和DAEC的菌株中均检测出了astA基因，基因在健康猪和疾病猪中均有发现，但是一旦与其他毒力基因如sta及F菌毛等同时存在于猪体内时，便能导致猪腹泻。

2 大肠埃希菌毒力基因与耐药性

至今，有关大肠埃希菌毒力基因和耐药性之间相关性研究相对少见。国内外研究表明，质粒、转座子、噬菌体及整合子基因盒等，这些可塑性的遗传因子使细菌基因具有可变性，其也是造成耐药性广泛传播的重要原因，揭示了获得外源性毒力基因的可能性。因此，如果毒力基因和耐药性基因位于相同的可移动元件上，则在抗生素的选择压力下，会引起共转移，造成毒力和耐药性的同时增强［25］。

国外一些学者已经报道了大肠埃希菌毒力基因和耐药性之间的联系，认为耐药基因和毒力基因间有分子联系。Petkovsek Z等［26］对皮肤软组织分离的人源大肠埃希菌中耐药和毒力基因间的相关性进行了分析，结果发现环丙沙星和四环素耐药菌株拥有的毒力基因显著低于敏感株，而阿莫西林耐药株和敏感株拥有的毒力基因没有显著性的差异。Akua A S等［27］研究结果显示禽类的肠外致病性大肠埃希菌（ExPEC）毒力因子能够加强这些菌株在肠外的致病性，但是并没有发现其与耐药基因或者毒力基因之间有相关性。

3 小结

随着动物疾病种类的增多，导致疾病预防中药物的使用以及养殖业中的饲料添加剂急剧增加，使病原微生物出现耐药性，特别是多重耐药性菌株在动物机体中的出现。在这种严峻的形式下，如何预防和控制动物疾病是一个亟待解决的问题。如今，国内外学者均认为大肠埃希菌较易产生耐药性而且变化快，随时间的推移大肠埃希菌的耐药率逐渐上升，多重耐药菌株迅速增多以及耐药谱扩增。大肠埃希菌为适应各种新环境，其毒力基因通过各种不同的机制引起动物机体肠道、泌尿道等各器官的疾病。大肠埃希菌毒力基因不仅存在于细菌染色体中，还存在于质粒、噬菌体等中，通过侵袭机体组织引起发病，它所编码的毒素、黏附因子及定植因子等毒力因子相互协调起作用。详细了解大肠埃希菌毒力基因可以确定大肠埃希菌的病原型别，对确定动物疾病的传染源以及提供流行病相关性证据起重要作用，对保证食品安全、疾病的流行病学调查及防控具有重要意义。

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