茶多酚在大鼠肠道的吸收动力学研究

2014-03-22李丹初阳杨倩

中国医科大学学报 2014年10期

关键词：试液灌流茶多酚

李丹，初阳，杨倩

（1.沈阳医学院附属中心医院药剂科，沈阳110020；2.中国医科大学附属第一医院药学部，沈阳110001；3.沈阳药科大学药剂教研室，沈阳110024）

茶多酚在大鼠肠道的吸收动力学研究

李丹1，初阳2，杨倩3

（1.沈阳医学院附属中心医院药剂科，沈阳110020；2.中国医科大学附属第一医院药学部，沈阳110001；3.沈阳药科大学药剂教研室，沈阳110024）

目的研究茶多酚在肠道中的吸收部位和吸收机制。方法分别通过对大鼠的十二指肠、空肠、回肠进行在体肠吸收实验，用紫外分光光度法测定茶多酚的含量，计算出茶多酚的表观吸收系数Papp和吸收速率常数Ka，反映茶多酚的吸收部位和吸收机制。结果灌流速度不同，Ka和Papp有显著差异（P＜0.05）；药物浓度不同，Ka和Papp无显著差异（P＞0.05）；在相同的灌流速度及质量浓度下，茶多酚在大鼠不同肠段的吸收速率常数Ka和表观吸收系数Papp无显著差异（P＞0.05）。结论茶多酚的吸收不受其质量浓度的影响，茶多酚在全肠段吸收情况较差，制剂时应考虑增加茶多酚的脂溶性。

在体肠吸收；茶多酚；单相灌流法；紫外分光光度法；大鼠

茶为山茶科灌木或小乔木植物，其干燥叶为茶叶Camellia sinensis（L.）O.Kuntze。茶起源于中国，作为保健饮品已有数千年历史［1］。世界上现存最早的药典《新修本草》首次详细记载了茶的性味及功效：“茗，苦茶，味甘、苦，微寒，无毒，主痰疮，利小便，去淡渴，令人少睡，秋采之。主下气，消宿食［2］”。茶叶巨大的生物学价值已经逐渐成为各界学者的研究热点。研究表明，茶叶中含有大量的多酚类化合物、氨基酸、多糖类物质、咖啡碱及多种维生素和矿物质［3］，其中以茶多酚含量最多，约占茶叶总量的30%。近年来，大量研究发现茶多酚具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗辐射、抗高血脂、防治动脉粥样硬化和抗病毒等药理学活性［4］。然而目前并未见有关茶多酚在体肠吸收的相关报道。本研究拟探讨茶多酚的在体肠吸收情况，为茶多酚处方设计奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

茶多酚提取物（湖北绿源生物技术有限公司）；UV-9100紫外-可见分光光度计（北京瑞利分析仪器公司）；BSA124S型电子分析天平（德国赛多利斯集团）；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市英峪予华仪器厂）；HL-2恒流泵（上海青浦沪西仪器厂）；SZ-97自动三重纯水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂）。

1.2 实验动物Wistar大鼠，雄性，体质量180～220 g（沈阳药科大学动物中心提供），动物合格证号：SCXK（辽）2010-0001。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制：（1）空白灌流液［5］—K-R试液：称取CaCl20.37 g，KCl 0.35 g，NaCl 7.8 g，MgCl20.02 g，NaHCO31.37 g，NaH2PO40.32 g和葡萄糖1.4 g，加蒸馏水溶解并定容至1 000 mL，备用。（2）酒石酸亚铁溶液：将C4O6H2KNa 5 g和FeSO41 g加蒸馏水溶解并定容至1 000 mL。（3）pH7.5磷酸盐缓冲液Na2HPO4溶液（溶液A）：将23.377 g Na2HPO4加水溶解，并定容至1 000 mL；KH2PO4溶液（溶液B）：精密称取9.078 g KH2PO4，加水溶解并定容至1 000 mL；取85 mL溶液A和15 mL溶液B混合均匀，即得pH7.5磷酸盐缓冲液。

1.3.2 实验操作：为消除实验过程中管路可能对药物产生的吸附作用，实验前需用供试液冲洗管路，直至出液口药物浓度与供试液浓度相同。大鼠禁食12 h，自由饮水，腹腔注射20%乌拉坦（剂量10 mL·kg-1）麻醉后固定于实验台上。沿腹中线打开大鼠腹腔，分离待考察肠段，两端切口并用37℃生理盐水将肠内容物冲洗干净，插管后结扎。将浸有生理盐水的脱脂棉覆盖在伤口处保湿，同时用红外灯照射进行保温。进口处用装有供试液的小瓶进行灌流，开始计时后预平衡30 min，之后每隔15 min在出口处用另一重量已知的小瓶收集1次，实验持续时间105 min。分别于计时后的45、60、75、90、105 min取样，并迅速更换下一个供试液小瓶和收集液小瓶，称质量，计算灌入和收集的供试液重量。实验结束后采用心脏麻痹法处死大鼠，将实验肠段剪下，测量其长度（l）和内径（r）。所取样品经0.45 μm微孔滤膜滤过后进行测定。采用重量法［6］按下式计算药物吸收速率常数（Ka）和表观吸收系数（Papp）：

公式中：Vout和Vin分别为出肠液和入肠液体积（mL），假定出肠液与入肠液的密度均为1.0 g·cm-3，则可根据测得的入肠液和出肠液的质量计算其体积；ν为灌流速度；l和r分别为被考察肠段的长度（cm）和横截面半径（cm），ρout、ρin分别为出肠处和入肠处灌流液中药物的质量浓度（mg·mL-1）。

2 结果

2.1 方法学评价

2.1.1 专属性：分别取pH7.4的K-R试液4 mL和酒石酸亚铁溶液5 mL置于25 mL容量瓶中，加入pH7.5的磷酸盐缓冲液稀释至刻度。另取一个25 mL容量瓶，除不加K-R外，其余配制溶液操作同上，并以此作为空白溶液。在波长200～700 nm范围内进行扫描，结果见图1。扫描图谱显示K-R试液在500～700 nm波长范围内无特定吸收波长，对药物测定无干扰。

图1 K⁃R试液的紫外扫描图Fig.1 UV spectra of Krebs⁃Ringer buffer

2.1.2 吸收波长的选择：称取干燥至恒重的茶多酚粉末适量于25 mL容量瓶中，依次加入酒石酸亚铁溶液5 mL和pH7.4 K-R试液4 mL，充分混匀后再加入pH7.5磷酸盐缓冲液定容至刻度。另取25 mL容量瓶，同上操作但不加茶多酚，作为空白溶液。采用紫外分光光度法进行全波长扫描，结果见图2。如图所示：茶多酚在554 nm处有最大吸收，故选择554 nm作为茶多酚含量检测的波长。

图2 茶多酚对照品溶液的紫外扫描图Fig.2 UV spectra of reference substance tea polyphenol

2.1.3 标准曲线：精密称取干燥至恒重的茶多酚粉末50 mg至50 mL容量瓶中，加入适量pH7.4 K-R试液溶解后定容至刻度，即得浓度为1 mg·mL-1的储备液。分别精密吸取上述储备液0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL置于25 mL容量瓶中，依次加入酒石酸亚铁溶液5 mL和K-R试液4 mL，混匀后用pH7.5磷酸盐缓冲液定容至刻度。以储备液加入量为0.0 mL的溶液作为空白，用1 cm比色杯，在554 nm波长处测定吸光度A。以A对茶多酚的浓度C（mg·mL-1）进行线性回归，标准曲线方程为：A＝8.9375C-0.018，r2=0.9995。结果表明，当茶多酚的浓度C在16～80 μg·mL-1范围内线性关系良好。

2.1.4 精密度：配制高、中、低3个浓度的茶多酚标准溶液，按“2.1.3”方法操作并测定吸光度，外标法换算出相应的浓度。每个浓度1 d内重复测定5次，计算日内精密度；每个浓度每日测定1次，连续测定5 d，计算日间精密度。结果如表1所示：该测定方法日内、日间精密度良好，符合方法学要求。

表1 日内、日间精密度Tab.1 Results of inter⁃day and intra⁃day precisions

2.1.5 溶液稳定性：取茶多酚供试品溶液3份，置37℃水浴中，分别于0、0.5、1.0、1.5、2.0 h取样，测定吸光度，计算RSD为0.78%。结果表明，茶多酚溶液在37℃水浴条件下2.0 h内稳定良好，可以满足实验需要。

2.2 影响药物吸收的因素

2.2.1 灌流速度：Wistar大鼠15只，随机分为3组，取浓度为0.049 7 mg·mL-1的茶多酚供试液进行十二指肠单向灌流。考察当灌流速度分别为0.3、0.6、 0.9 mL·min-1时，十二指肠对药物吸收的影响。按“1.3.2”方法进行操作，测定茶多酚的表观吸收系数Papp和吸收速率常数Ka，结果如表2所示：灌流速度对茶多酚的Ka和Papp影响显著。随着灌流速度的加快，Ka和Papp值呈线性增大。

表2 灌流速度对茶多酚吸收速率常数和表观吸收系数的影响（n= 5Tab.2 The effects of perfusion rates on Papp and Ka of tea polyphone

1）P＜0.01 vs the group of 0.3 mL·min-1.

2.2.2 药物浓度：Wistar大鼠15只，随机分为3组，分别取质量浓度为0.018 2、0.048 5和0.078 3 mg·mL-1的茶多酚供试液进行十二指肠单向灌流，灌流速度为0.3 mL·min-1。考察药物的质量浓度对药物吸收的影响。按“1.3.2”方法进行操作，测定茶多酚的表观吸收系数Papp和吸收速率常数Ka，结果如表3所示，茶多酚的质量浓度对十二指肠的吸收速率常数Ka和表观吸收系数Papp均无显著性影响（P＞0.05）。说明茶多酚在大鼠十二指肠段的吸收不受其质量浓度的影响，推测其药物吸收机制可能为被动扩散。

表3 药物浓度对茶多酚吸收速率常数和表观吸收系数的影响（n= 5Tab.3 The effects of concentrations on Papp and Ka of tea polyphone

2.2.3 吸收部位：Wistar大鼠15只，随机分为3组，取浓度为0.049 7 mg·mL-1的茶多酚供试液浓度，灌流速度为0.3 mL·min-1。考察不同的灌流部位（十二指肠、空肠、回肠）对药物吸收的影响［7］。按“1.3.2”方法进行操作，测定茶多酚的表观吸收系数Papp和吸收速率常数Ka，结果如表4所示：在相同的灌流速度下，茶多酚在大鼠小肠不同肠段的吸收速率常数Ka和表观吸收系数Papp之间无统计学差异（P＞0.05），其中以空肠的吸收速率常数Ka较大，其次为十二指肠和回肠。说明茶多酚在小肠内无特定的吸收部位。

表4 小肠吸收部位对茶多酚吸收速率常数和表观吸收系数的影响Tab.4 The effects of absorption sites on Papp and Ka of tea polyphone

3 讨论

本研究建立了茶多酚大鼠在体肠吸收的紫外分析方法，结果表明该方法精密度、回收率、稳定性均良好，空白灌流液不干扰测定，符合方法学要求。本研究采用单向灌流法研究了茶多酚在大鼠小肠各肠段的吸收情况，结果显示茶多酚在大鼠小肠不同肠段的吸收速率常数Ka和表观吸收系数Papp之间无统计学差异（P＞0.05），其中空肠的吸收速率常数Ka较大，其次为十二指肠和回肠。同时随着灌流速度的加快，Ka和Papp值呈线性增大；而茶多酚的浓度对Ka和Papp值基本无影响，故推测茶多酚在大鼠小肠吸收的主要机制可能为被动扩散。

在体肠灌流法可以将体外与体内相结合，并采用重量法来标示灌流液的体积变化。在保证在体实验的情况下使实验操作更加简便，有利于作为临床口服药物的评价方法。

茶多酚在大鼠小肠吸收的研究是处方前工作的重要组成部分，可以指导药剂学研究人员针对药物的吸收特点选择相应的剂型，以保证和提高制剂的生物利用度。由于茶多酚为茶叶中提取的多酚羟基类化合物，分子极性较大，水溶性较强而被生物膜吸收的情况较差，故推测其生物利用度较低。本研究结果证实，茶多酚在大鼠小肠各肠段的吸收情况均不理想，故制剂时应考虑增加茶多酚的脂溶性以增强其在肠段的吸收。

研究中应该注意的是为消除实验过程中管路对药物吸附的影响，实验前应取供试液冲洗管道，冲洗至出液口药物浓度与供试液浓度相同。

［1］刘军海，李志洲.茶叶中有效成分应用及其提取工艺研究进展［J］.食品研究与开发，2007，28（3）：173-177.

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［3］黄海英，黄秀鑫，朱荣辉，等.茶叶保健与四季养生［J］.广东农业科学，2010，37（6）：166-168.

［4］张晓梦，倪艳，李先荣.茶多酚的药理作用研究进展［J］.药物评价研究，2013，36（2）：157-160.

［5］辛然，陈彦，贾晓斌，等.枳实中黄酮成分及其提取物大鼠肠吸收特性研究［J］.中国中药杂志，2010，35（14）：1850-1854.

［6］聂淑芳，潘卫三，李伟，等.长春西汀的大鼠在体肠吸收研究［J］.中国医药工业杂志，2006，36（10）：625-628.

［7］黄勇，唐丽，刘跃，等.野黄芩素在体肠吸收动力学研究［J］.中国新药杂志，2014，23（4）：457-461.

（编辑王又冬）

Study on Absorption Kineticsof Tea Polyphenolin Rat Intestine

LIDan1，CHUYang2，YANGQian3
（1.DepartmentofPharmacy，Affiliated CentralHospitalofShenyang MedicalCollege，Shenyang 110020，China；2.DepartmentofPharmacy，The FirstHospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110001，China；3.DepartmentofPharmaceutics，Shenyang PharmaceuticalUniversity，Shenyang 110016；China）

ObjectiveTo investigate the absorption mechanism and absorption site oftea polyphenolin intestine.MethodsThe absorption mechanism was studied by using an in vivo intestinal rat model including duodenum，jejunum and ileum.The concentration of tea polyphenol was determined by UV-spectrophotometry，and then the absorption rate constant（Ka）and apparent absorption coefficient（Papp）was calculated，which may reflect the absorption mechanism and absorption site of tea polyphenol.ResultsPerfusion rate could significantly affect Ka and Papp（P＜0.05）；there was only little effectofdrug concentration on Ka and Papp（P＞0.05）.No significantdifference was found between Ka and Papp values of intestinal sections when at the same perfusion rate and drug concentration（P＞0.05）.ConclusionThe absorption of tea polyphenol was not affected by drug concentration.The absorption oftea polyphenolin generalintestinalsegments is poor.We should considerto improve the lipid solubility oftea polyphenolwhen making preparations fortea polyphenol.

in situ intestinal absorption；tea polyphenol；unidirectional enteroclysm；UV-Vis；rat

R969.1

0258-4646（2014）10-0914-04

沈阳市科学技术计划项目（1091142-9-00）

李丹（1976-），女，副教授，硕士. E-mail：lidanjerry@126.com

2014-06-20

网络出版时间：