帕金森病患者共核蛋白基因复制子的调查及血清共核蛋白表达水平的研究

李培，罗晓光，李冯锐，3，姜恩珠，景晨晨，任艳，庞灏

（1.中国医科大学法医学院血清学教研室，沈阳110001；2.中国医科大学附属第一医院神经内科，沈阳110001；3.包头医学院法医学系，内蒙古包头014060）

帕金森病患者共核蛋白基因复制子的调查及血清共核蛋白表达水平的研究

李培1，罗晓光2，李冯锐1，3，姜恩珠1，景晨晨1，任艳2，庞灏1

（1.中国医科大学法医学院血清学教研室，沈阳110001；2.中国医科大学附属第一医院神经内科，沈阳110001；3.包头医学院法医学系，内蒙古包头014060）

帕金森病（PD）的发病机制与遗传因素密切相关，调查形成中脑黒质多巴胺能神经元内病理性路易小体（LB）的主要成分α-共核蛋白的基因（SNCA）在散发PD患者的突变；同时了解α-共核蛋白在血液中的浓度。方法抽取210名散发性PD患者和80名正常人的静脉血，分离血清后，分别提取RNA和基因组DNA；采用实时定量PCR方法分析SNCA基因的剂量变化以及mRNA表达的水平；应用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清中α-共核蛋白的表达水平。结果SNCA基因外显子1基因组水平相对定量结果显示，1个散发PD患者比值为1.6，其余PD患者和正常个体的比值在0.8～1.2之间；基因组水平比值增加的PD患者mRNA表达水平与其他PD患者及正常个体比较显著增加（P＜0.05）；但该患者血清中α-共核蛋白表达水平与其他PD患者及正常个体之间差别没有统计学意义（P＞0.05）。结论汉族散发PD患者中存在SNCA基因双拷贝复制，但出现频率极低；血清中α-共核蛋白的检测目前不能视为PD分析的有效生物学指标。

帕金森病；α-共核蛋白；SNCA；复制突变

帕金森病（Parkinson′s disease，PD）是中老年人群中除阿尔兹海默病外最常见的神经系统退行性疾病，在65岁以上的人群中发病率约为1%［1，2］，其临床特点有静止性震颤、肌肉强直、运动迟缓和姿势步态异常等。病理特征主要是中脑黑质致密部多巴胺能神经元进行性变性丢失，纹状体区多巴胺含量减少，以及残存的多巴胺能神经元内出现以α-共核蛋白为主要成分的嗜酸性包涵体——路易小体（Lewy body，LB）［3～5］。迄今为止，PD的病因和发病机制仍未完全明确，但随着PD相关易感基因的发现，遗传作为重要因素在PD的发病机制中的作用越来越受到重视。目前已经发现至少18个“PARK”位点，其中的α-共核蛋白基因（SNCA，也称为PARK1/ PARK4），是最早鉴定出的与PD相关的基因。该基因与常染色体显性遗传家族性PD相关，A53T、A30P和E46K是发现在少数西方PD患者中的3个编码区错义突变；此外，也有研究报道了SNCA基因的复制可导致PD。然而，在我国至今未发现任何SNCA基因编码区的突变，相关的SNCA基因的复制研究也尚未见报导。

为探讨SCNA基因突变与中国汉族人群散发性PD的关系，本研究采用实时定量PCR的方法，对散发性PD患者中是否存在SNCA外显子的复制突变进行调查，同时应用ELISA方法检测了α-共核蛋白在PD患者血清中的表达水平以及外周血白细胞中mRNA表达水平，明确血清中α-共核蛋白浓度及mRNA水平是否可以作为PD诊断及病情判断的生物学标记。

1 材料与方法

1.1 研究对象

210例散发性PD患者均选自中国医科大学附属第一医院神经内科，汉族，PD患者的临床诊断依据英国帕金森病协会脑库标准。其中男109例，女101例，患者年龄（62.59±10.72）岁。正常对照组为80例与患者年龄和性别相匹配的无血缘关系正常体检者，其中男48例，女32例。正常对照组与散发性PD患病组在性别和年龄方面无统计学差异（P＞0.05），均知情并获得同意。

1.2 基因组水平实时定量分析

抽取210例散发性PD患者和80例正常对照者的肘静脉血各5 mL，枸橼酸钠抗凝，分离白细胞后，部分保存于-80℃备用；部分采用常规酚-氯仿法抽提基因组DNA。

实时荧光定量PCR方法检测SNCA基因的复制。本研究选择基因组水平对SNCA基因的外显子1进行实时定量分析，同时选择β-2-微球蛋白基因（B2M）为内参基因，所用引物序列分别为：SNCAexon 1上游5′-AGGACGGCGACGACCAGA-3′；exon 1下游5′-AGGACGCTCTCGGAGGGG-3′；B2M上游5′-TCACGTCATCCAGCAGAGAATG-3′；B2M下游5′-CAGTGGGGGTGAATTCAGTGTAG-3′。PCR反应体系总体积为20 μL，其中包括SYBR®Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）（2×）（TaKaRa Cat. #RR820A）10 μL，ROX Reference Dye II（50×）（Ta-KaRa Cat.#RR820A）0.4 μL，上游引物和下游引物（10 μmol/L）各0.3 μL，基因组DNA模板浓度均稀释到7 ng/μL后，每个体系内加2 μL。按照两步法PCR扩增标准程序，第一步预变性：95℃30 s；第二步PCR反应：95℃5 s，65℃34 s，循环40次；第三步解离阶段：95℃15 s，60℃30 s，95℃15 s。扩增产物用7 500实时定量PCR系统（AB applied biosystems）进行分析检测。SNCA基因外显子1的峰值分别与内参比较，Livak方法，即2-△△Ct法，进行数据分析处理。无复制的正常个体的比值范围为0.8～1.2；比值范围为1.3～1.7与1.8～2.2可考虑为SNCA基因的二倍复制或三倍复制突变。

1.3 RNA水平实时定量分析

采用RNAisoTMplus试剂盒从先前保存的白细胞中提取RNA，Primer ScriptTMRT reagent Kit（Perfect Real Time）（TaKaRa Code：DRR037S）反转录得到SNCA基因的cDNA。参照上述基因组DNA实时定量分析方法进行cDNA实时定量PCR检测。同样选取B2M基因作为内参。2-△△Ct方法进行数据分析处理。

1.4 酶联免疫吸附反应（ELISA）

测定样本血清蛋白浓度后，向96孔板中分别加入浓度为1，10，20，40，80，100 μg/μL的患者血清样本100 μL，4℃孵育过夜；PBST洗涤后，加入PBST/ 0.2%BSA稀释的α-共核蛋白抗体，抗体浓度分别为1∶200，1∶400，1∶800，1∶1 600，4℃孵育过夜；PBST/ 0.2%BSA洗涤后，向每孔中加入100 μL辣根过氧化物酶标记的二抗，室温下孵育60 min；洗涤后向每孔各加100 μL TMB显色试剂，室温孵育30 min后，在波长为370 nm处测定吸光值。

1.5 统计学分析

应用SPSS 13.0和Excel 2003统计软件进行相关数据处理以及统计分析。组间的差异应用χ2检验及t检验。P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1SNCA外显子1基因组水平复制的分析

采用相对定量PCR方法（图1、图2）进行基因组水平的SNCA基因外显子1及内参基因B2M的定量分析，经2-△△Ct方法进行数据分析后所得到的结果如图3所示。结果显示本研究仅发现1例PD患者（PD137）的比值为1.6，其余被检测样本的比值在0.8～1.2之间。这样，从遗传学角度上提示，SNCA基因的基因组水平复制罕见。

图3 基因组水平实时定量分析Fig.3 Quantitative real⁃time PCR in genomic DNA level

2.2SNCAmRNA表达水平分析

为了验证基因组DNA水平定量分析的结果，我们选择了3个PD样本（PD1、PD2、PD137；PD1和PD2是荧光定量在正常范围的PD患者）和3个正常对照样本外周血分离的白细胞，提取其RNA，并检测了SNCAmRNA表达水平。定量分析结果发现PD137的SNCAmRNA表达水平（40.343 0）与另2个PD个体（PD1为2.081 3，PD2为2.378 1，均值为2.229 7）及正常对照（1.0）的SNCAmRNA表达水平比较存在统计学差异（P＜0.05），结果提示DNA水平的定量与mRNA水平定量相符合。

2.3 PD患者血清α-共核蛋白的表达水平

采用ELISA法分别在不同血清浓度和不同抗体浓度的条件下对PD1和PD2患者（荧光定量在正常范围，P0组）、PD137患者（PD137组）和3个正常个体（对照组）的血清中α-共核蛋白表达水平进行了检测。结果显示，PD患者血清中α-共核蛋白表达水平与正常对照比较没有明显变化（P＞0.05）。见表1、表2。

表1 PD和正常对照患者不同血清浓度α⁃共核蛋白表达水平Tab.1 Expression level of α⁃synuclein in serum different concentration in PD patients and normal controls

表2 PD和正常对照组不同抗体浓度血清中α⁃共核蛋白表达水平Tab.1 Expression level of α⁃synuclein in serum in PD patients and normal controls（different concentration of antibody）

3 讨论

SNCA（MIM#163890）基因位于人类染色体4q22.1，包含6个外显子，编码140个氨基酸组成的蛋白质。1997年，Polymeropoulos等学者［6］在1个意大利人和3个希腊人起源的常染色体显性遗传PD家系中首次发现了致病的SNCA基因编码区中的突变A53T，这也是第1个证明的与PD发病具有直接关联的致病遗传位点。这一结果也直接导致了PD研究中的划时代发现，即SNCA基因产物与形成PD黑质纹状体病理学上特征性路易小体密切相关。这样，为了进一步调查PD人群中SNCA基因变异的作用，1998年，Krüger等［7］对192例散发PD患者和7例有PD家系病史患者的SNCA基因所有编码外显子进行了详细的突变分析，又鉴定出了1个新的SNCA基因编码区突变A30P。然而，随后基于大量的群体学进行的研究SNCA基因的错义突变并不常见。最新的PD数据库网站［8］公布的结果显示，加上新鉴定的E46K和H50Q，也仅仅在表现出显性PD特征的群体中发现了4种不同的SNCA基因错义突变，而且发生频率极低。与错义突变比较，SNCA基因的拷贝数变异似乎在PD群体中发现的种类更多，研究的也较为广泛。自从Singleton等［9］在1个PD的家系中首先观察到了野生型SNCA基因在基因组范围内存在复制现象后，包括完整SNCA基因的缺失、双重和三重复制在不同的种族和地区均有报导。研究发现存在剂量差异的SNCA基因在基因组中的构成大小是不一致的，这一结果提示SNCA基因的拷贝数变异发生于不同的独立突变事件。来自亚洲群体的研究数据显示，日本和韩国PD家系和散发的PD均鉴定出SNCA基因的复制，进一步验证了SNCA基因复制导致了相应的功能增益，同时也提示SNCA基因复制也可能是亚洲群体中散发PD的一种遗传因素［10～12］。因此，本研究选择汉族群体进行了SNCA基因复制的调查，在210名散发PD患者中发现1例SNCA外显子1呈现双重复制剂量改变，频率约为0.48%，研究结果表明在中国PD患者中也存在SNCA基因复制现象，出现率与以前亚洲群体中的报导相似，进一步的全国范围内大样本调查将会验证本研究结果，同时也将为SNCA基因复制在中国PD患者中的分布及类型的确定提供有力的支持。

选择强有力的方法从基因组水平确定SNCA基因复制是1个关键点。最初鉴定的三重复制首先选择了基因组DNA实时定量PCR技术，同时结合测量SNCA基因侧翼遗传标记是否遵循孟德尔遗传规律［13］以及相应的剂量效应，然后对疑似存在拷贝数变异的样本进行荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）确证；或者辅以比较基因组杂交（comparative genomic hybridization，CGH），再借助图像分析技术对染色体拷贝数量的变化进行定量。之后的研究也有选择SNP芯片、单倍型分析及PCR步移（PCR walking）等策略对SNCA基因复制进行分子水平定性［14］。随着实时定量PCR技术的成熟和广泛应用，众多的学者们首先偏爱采用半定量PCR方法，从基因组水平对家族性和散发性PD是否存在SNCA基因复制进行调查，研究中选择不同的SNCA外显子和内参序列进行扩增和剂量分析［15，16］，对不同的种族和地区PD群体存在的SNCA拷贝数变异进行了良好的评估。因此，本研究依据SNCA外显子1的半定量分析，参照与内参基因的相对定量，发现了1个拷贝数增加的PD个体。本研究也从mRNA水平上观察了该个体SNCA的表达变化，借助实时定量分析，显示出SNCAmRNA表达水平增加。这样，本研究支持从基因组水平进行SNCA基因复制的分析；同时，研究结果表明从血中进行SNCA基因拷贝数变异的mRNA表达水平分析，在没有阳性对照及CGH等技术做进一步验证的前提下，可以对基因组水平结果起到辅助支持作用。

从血液中选择合适的生物标记进行PD等疾病的诊断、治疗和预后评估等具有重要的意义，特别是了解α-共核蛋白在PD患者血中的浓度更加凸显其价值。众多的研究发现家族性PD患者表型的严重程度取决于SNCA基因的拷贝数及α-共核蛋白水平［13，17，18］。与PD患者的中脑主要病理改变比较，即病理性多巴胺能神经元中存在大量的由α-共核蛋白构成的路易小体，血液中的细胞具有不同的表达谱。已有研究发现，人类外周血液中的单核细胞和血小板等细胞中存在α-共核蛋白的表达［19，20］，并且相关的研究还发现α-共核蛋白可以分泌到血浆中［21，22］。因此，本研究采用ELISA方法，分别在不同血清浓度（1，10，20，40，80，100 μg/μL）和不同抗体浓度（1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600）的条件下检测PD患者及正常人群血清中的α-共核蛋白水平，结果显示PD患者血清中α-共核蛋白表达水平与正常对照比较没有明显变化（P＞0.05）。这可能说明检查方法的灵敏度或抗体的特异性及滴度需要在接续的研究中加以验证和考虑；同时，也可能说明血液中的α-共核蛋白浓度的检测目前还不能作为PD分析的生物标记。

总体来说，SNCA基因突变频率较低，其中的SNCA基因的复制目前研究显示也约占PD遗传因素的2%，且在不同人群中可能存在种族差异。我们在国内首次应用相对定量PCR的方法对中国汉族人群散发性PD患者进行SNCA基因分析，尽管SNCA基因拷贝数变异在中国汉族人群中罕见，但是为常染色体显性遗传特征的SNCA基因突变在PD人群中的研究提供了重要的数据。

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（编辑 武玉欣）

Screening ofα-synuclein Gene Duplication in Patientswith Parkinson′s Disease and Determination of α-synuclein Expression Levelin Serum

LIPei1，LUOXiao-guang2，LIFeng-rui1，3，JIANG En-zhu1，JINGChen-chen1，REN Yan2，PANGHao1
（1.Department of Forensic Serology，School of Forensic Medicine，China Medical University，Shenyang 110001，China；2.Department of Neurology，The First Hospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110001，China；3.DepartmentofForensic Medicine，Baotou MedicalCollege，Baotou 014060，China）

ObjectiveThe etiology of Parkinson′s disease（PD）is closely related to genetic factor.To explore the α-synuclein gene（SNCA）duplication，which composes the constituents of Lewy body（LB）in dopaminergic neurons of mesencephalon，in sporadic PD patients and controls，and evaluate the α-synuclein′s concentration in serum.MethodsVenous blood samples were collected from 210 PD patients and 80 normal controls inhabited in north China.Genomic DNA，as well as RNA from several individuals，was respectively extracted.The dosage change ofSNCAgene in both genomic DNA level and mRNA expression level was determined by quantitative real-time PCR.The α-synuclein′s concentration in serum was measured by enzyme-linked immunosorbentassay（ELISA）.ResultsWe found thata relatively quantitative ratio ofexon 1 ofSNCAgene to reference gene in a PD patientwas above 1.6.The ratio in the remained PD individuals and controls were between 0.8 and 1.2.The mRNAexpression level ofSNCAin the PD patient was also significantly increased compared with other PD patients and controls.While no obvious vibrations was observed oftheα-synuclein protein expression levelin blood serum in allPD patientsand normalcontrols.ConclusionTheSNCAgene duplication rarely exists in sporadic PD patient inhabited in north China.The measurement of α-synuclein protein in serum may not be an effective biomarker concerning with PD so far.

Parkinson′s disease；α-synuclein；SNCA；gene duplication

R741

A

0258-4646（2014）10-0874-05

国家自然科学基金（81172713）

李培（1987-），女，硕士研究生.

庞灏，E-mail：panghao@mail.cmu.edu.cn

2014-07-11

网络出版时间：