合成唾液酸乳糖重组大肠杆菌的构建

靳文斌 张萧萧 李玉 路福平

（天津科技大学生物工程学院 工业发酵微生物教育部重点实验室 工业酶国家工程实验室 天津市工业微生物重点实验室，天津 300457）

合成唾液酸乳糖重组大肠杆菌的构建

靳文斌 张萧萧 李玉 路福平

（天津科技大学生物工程学院 工业发酵微生物教育部重点实验室 工业酶国家工程实验室 天津市工业微生物重点实验室，天津 300457）

唾液酸寡糖具有抗感染、提高免疫力、促进双歧杆菌增殖等功能，对其微生物合成方法的研究具有重要的理论和应用价值。克隆和表达来源于Campylobacter jejuni的N-乙酰葡萄糖胺异构酶基因（neuC）、乙酰神经氨酸合成酶基因（neuB）、CMP-乙酰神经氨酸合成酶基因（neuA）和来源于Nesseria meningitidis的唾液酸转移酶基因（nst），利用表达载体pSTV29，在大肠杆菌Escherichia coli JM109内构建合成唾液酸乳糖的代谢途径。在接种量2%、装液量50 mL/250 mL三角瓶、摇床转速180 r/min、温度34℃的条件下发酵30 h，并以10 g/L乳糖为底物，利用HPLC检测到唾液酸乳糖的合成量为2.45 g/L，为人乳唾液酸寡糖及其类似物的异体合成提供了新的思路。

唾液酸乳糖 大肠杆菌 代谢工程

人乳寡糖及其类似物由于安全、可靠，不产生抗药性，并且具有部分免疫功能［1］，以人乳寡糖及其类似物为原料开发新型药物成为当前医药领域的一大热点。目前我国对人乳寡糖的研究开发仍处于初始阶段且多采用化学合成法获得人乳寡糖及其类似物。由于糖苷供体价格昂贵［2］、合成路径复杂［3］及分离纯化困难，限制了人乳寡糖及其类似物的工业应用。伴随着相关基因不断解析和微生物代谢路径不断得到阐明［4-7］，使得利用生物技术的方法大量获得人乳寡糖成为可能。

唾液酸寡糖是人乳寡糖的重要组成成分，具有抗感染、提高免疫力、促进双歧杆菌增殖等功能［8］，

在食品医药行业具有广阔的市场前景，近年来受到人们的广泛关注。由于化学合成法涉及复杂的保护和去保护步骤，人们把目光转向了生物技术的方法。利用组合生物学技术，人们已成功合成壳聚糖［9，10］、岩藻糖基化寡糖［11］、神经节苷脂等碳水化合物［12］，为合成唾液酸寡糖提供了新思路，解决了难以实现规模合成的难题。

本研究主要是将来源于空肠弯曲杆菌（C. jejuni）的N-乙酰葡萄糖胺异构酶基因（neuC）、乙酰神经氨酸合成酶基因（neuB）、CMP-乙酰神经氨酸合成酶基因（neuA）和来源于脑膜炎奈瑟氏菌（N. meningitidis）的唾液酸转移酶基因（nst）引入大肠杆菌JM109，在其体内构建合成唾液酸乳糖的合成途径，以乳糖为底物合成唾液酸乳糖，合成途径如图1。

图1 合成唾液酸乳糖工程菌代谢途径

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种与质粒 Escherichia coli JM109和大肠杆菌表达质粒pSTV29均为本实验室保藏；重组质粒pUC57-neuA-neuB-neuC和pUC57-nst均由英潍捷基（上海）贸易有限公司进行neuA、neuB、neuC、nst基因合成时提供。

1.1.2 试剂 限制性内切酶PstⅠ、EcoRⅠ、KpnⅠ、SacⅠ和SolutionⅠ，大连宝生物工程有限公司；1 kb DNA Ladder、普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒，北京天为时代科技有限公司；氯霉素，上海生工生物工程公司；其他为国产分析纯试剂。

1.1.3 培养基 LB培养基（g/L）：蛋白胨10，酵母浸粉5，NaCl 10，pH7.0，121℃灭菌20 min。

发酵培养基（g/L）：葡萄糖40，酵母粉 5，硫酸铵5，磷酸氢二钠4，磷酸二氢钾0.5，pH6.8，115℃灭菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 工 程 菌JM109/pSTV29-neuA-neuB-neuC-nst的构建 将质粒pUC57-neuA-neuB-neuC和质粒pSTV29分别用限制性内切酶PstⅠ、EcoRⅠ双酶切，酶切产物经纯化回收后，用SolutionⅠ于16℃连接过夜，利用电转化法转入大肠杆菌Escherichia coli JM109中，通过氯霉素抗性平板筛选转化子，获得工程菌JM109/pSTV29-neuB-neuC，用同样的方法构建工程菌JM109/pSTV29-neuA-neuB-neuC和工程菌JM109/pSTV29-neuA-neuB-neuC-nst，重组质粒用双酶切法进行鉴定。

1.2.2 唾液酸乳糖及其中间产物的发酵合成 将构建的工程菌JM109/pSTV29-neuB-neuC、JM109/ pSTV29-neuA-neuB-neuC和 JM109/pSTV29-neuA-neuB-neuC-nst分别接种于5 mL LB液体培养基中，37℃ 180 r/min培养过夜。按2%接种量转入50 mL新鲜的大肠杆菌发酵液体培养基中，氯霉素终浓度为 40 μg/mL，34℃培养至OD600=0.4-0.6，加入IPTG至终浓度为1 mmol/L，34℃诱导培养30 h。

1.2.3 唾液酸乳糖及其中间产物的分析检测 HPLC和LC-MS分析条件为色谱柱：Aminex HPX-87H Column，300 mm×7.8 mm；检测器：示差折光检测器；流动相：H2O+0.05 mol/L H2SO4；柱温：40℃；进样量：10 μL；流速：0.5 mL/min。

取诱导培养后的发酵液和菌体细胞，超声破碎（功率500 W，振幅35%，每个循环超声4 s，冷却5 s，10 min），4℃，12 000 r/min下离心10 min，收集上清进行HPLC分析。用配置好的1 mg/mL的N-乙酰神经氨酸、1 mg/mL的唾液酸乳糖的标品溶液作为对照以确定发酵液中相应产物的出峰位置。并对发酵液进行LC-MS分析，对产物进行进一步确定。根据N-乙酰神经氨酸的分子量（311）、唾液酸乳糖的分子量（633）设定扫描质量范围100-700，负离

子模式，检测N-乙酰神经氨酸标品，再根据标品的信号大小设置SIM 碰撞诱导解离参数，进样量为10 μL检测发酵样品。

2 结果

2.1 工程菌JM109/pSTV29-neuA-neuB-neuC-nst的构建

2.1.1 重组质粒pSTV29-neuB-neuC的构建及鉴定将PstⅠ/EcoRⅠ双酶切处理过的质粒pUC57-neuA-neuB-neuC和质粒pSTV29与SolutionⅠ混合，连接产物转化大肠杆菌JM109，获得工程菌JM109/pSTV29-neuB-neuC。对阳性转化子质粒采用PstⅠ/EcoRⅠ双酶切验证，结果如图2所示。从图2中可以看出，在2 300 bp及3 000 bp左右出现两条带，与串联基因neuB、neuC和质粒pSTV29大小一致，说明重组质粒pSTV29-neuB-neuC构建成功。

2.1.2 重组质粒pSTV29-neuA-neuB-neuC的构建及鉴定 将PstⅠ/KpnⅠ双酶切处理过的质粒pUC57-neuA-neuB-neuC和 质 粒pSTV29与SolutionⅠ 混合，连接产物转化大肠杆菌JM109，获得工程菌JM109/pSTV29-neuA-neuB-neuC。对阳性转化子质粒采用PstⅠ/KpnⅠ双酶切验证，结果如图3所示。从图中可以看出，在2 900 bp及3 000 bp出现两条带，与串联基因neuA、neuB、neuC和质粒pSTV29大小一致，说明重组质粒pSTV29-neuA-neuB-neuC构建成功。

图3 重组质粒pSTV29-neuA-neuB-neuC酶切电泳图

2.1.3 重组质粒pSTV29-neuA-neuB-neuC-nst的构建及鉴定 将KpnⅠ/SacⅠ双酶切处理过的质粒pSTV-29-neuA-neuB-neuC和质粒pUC57-nst与SolutionⅠ混合，过夜连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，构建工程菌JM109/pSTV29-neuA-neuB-neuC-nst。对阳性转化子质粒采用PstⅠ/KpnⅠ双酶切验证，结果如图4所示。从图4中可以看出，在3 900 bp及3 000 bp出现两条带，与串联基因neuA、neuB、neuC、nst和质粒pSTV29大小一致，说明重组质粒pSTV29-neuA-neuB-neuC-nst构建成功。

图4 重组质粒pSTV29-neuA-neuB-neuC-nst酶切电泳图

2.2 唾液酸乳糖及其中间产物的分析检测

2.2.1 N-乙酰神经氨酸和CMP-乙酰神经氨酸的分析检测 工程菌JM109/pSTV29-neuB-neuC发酵后，对发酵反应液超声破碎，离心收集上清，HPLC检测结果如图5所示。由图5-B可以看出对发酵液进行HPLC分析，在大约14 min处出现了预期的峰，这与图5-A中N-乙酰神经氨酸标品的出峰时间相同，可以判定构建的工程菌JM109/pSTV29-neuB-neuC可以合成N-乙酰神经氨酸。

采用同样的发酵和检测方法，对工程菌JM109/ pSTV29-neuA-neuB-neuC合成CMP-乙酰神经氨酸的情况进行分析，HPLC检测工程菌JM109/pSTV29-neuA-neuB-neuC的发酵反应液在CMP-乙酰神经氨酸的出峰位置处没有吸收峰形成。

为了进一步确定所生成的产物是N-乙酰神经氨酸，应用LC-MS对发酵产物进行质谱分析。发酵样

品检测结果如图6所示，根据N-乙酰神经氨酸的结构及分子量，设置扫描质量范围为100-700，在负离子模式下，得到N-乙酰神经氨酸标品的M/Z：334（M+Na）-。

图5 N-乙酰神经氨酸标品和发酵液液相色谱图

如图6-A，N-乙酰神经氨酸标品的信号大小设置SIM 碰撞诱导解离参数为334，进样量为10 μL。检测发酵样品，如图6-B所示，发酵样品出现的质谱信号发现在M/Z：334.1（M+Na）-有离子峰，这与N-乙酰神经氨酸标品离子峰大小一致，进一步证明了发酵液中的产物为N-乙酰神经氨酸。

2.2.2 产物唾液酸乳糖的分析检测 工程菌JM109/ pSTV29-neuA-neuB-neuC-nst发酵后，超声破碎，离心收集上清，发酵样品检测结果如图7所示。由图7-B可以看出对发酵液进行HPLC分析时，在大约8 min处出现了预期的峰，这与图7-A中唾液酸乳糖标品的出峰时间相同，对照组中同样在相同时间具有吸收峰，但是在8 min处图7-B中峰面积与图7-C中峰面积相比较，在8 min处图7-B峰面积明显偏大，因此可以判定构建的工程菌JM109/pSTV29-neuA-neuB-neuC-nst合成了唾液酸乳糖。

图6 N-乙酰神经氨酸标品和发酵样品的质谱分析

为了进一步确定所生成的产物是唾液酸乳糖，应用LC-MS对发酵产物进行质谱分析。发酵样品检测结果如图8所示，根据唾液酸乳糖的结构及分子量，设置扫描质量范围为100-700，在负离子模式下，得到唾液酸乳糖标品的M/Z：632（M-H）-。

图7 唾液酸乳糖标品和发酵液液相色谱图

根据标品的信号大小设置SIM 碰撞诱导解离参数为632，进样量为10 μL检测发酵样品，如图8-B所示，发酵样品在出现的质谱信号发现在M/Z：632（M-H）-有离子峰，这与唾液酸乳糖标品离子峰大小一致，而对照菌在相应的位置却没有离子峰出现，进一步证明了发酵液中的产物为唾液酸乳糖。

3 讨论

在哺乳动物体内CMP-乙酰神经氨酸的生物合成通路受到N-葡萄糖胺异构酶的调节控制［13］，具体表现为CMP-乙酰神经氨酸反馈抑制N-葡萄糖胺异构酶的活性。在微生物体内这种反馈抑制途径还没得到证实，然而细菌来源的N-葡萄糖胺异构酶与哺乳动物来源的N-葡萄糖胺异构酶表现出较高的序列同源性，因此在微生物体内也可能存在相似的反馈抑制途径。这就可以解释在串联了neuA、neuB、neuC三个目的基因的重组菌中发酵后在在发酵液中检测不到N-乙酰神经氨酸且CMP-乙酰神经氨酸的合成量较少。Fierfort［14］在同时引入neuA、neuB、neuC的工程菌中检测不到N-乙酰神经氨酸，本研究结果也证实了这个观点。

图8 唾液酸乳糖标品和发酵样品的质谱分析

以10 g/L乳糖为底物，180 r/min 34℃持续发酵30 h，唾液酸乳糖的合成量为2.45 g/L，Drouillard等［15］利用重组大肠杆菌采用高密度持续发酵的方法，唾液酸乳糖的合成量为34 g/L，与其相

比我们构建的重组菌由于没有敲除乙酰神经氨酸醛缩酶基因（nanA）、乙酰神经氨酸激酶基因（nanK）等，导致合成的N-乙酰神经氨酸通过其它途径进行分解代谢，从而影响终产物唾液酸乳糖的累积量，此外发酵控制条件和选用的表达载体也会影响唾液酸乳糖的合成量。尽管如此，本研究仍对唾液酸乳糖的异源合成做出了有益探索。

4 结论

本试验利用基因工程技术成功地将来源于空肠弯曲杆菌（Campylobacter jejuni）的N-乙酰葡萄糖胺异构酶基因（neuC）、乙酰神经氨酸合成酶基因（neuB）、CMP-乙酰神经氨酸合成酶基因（neuA）和来源于脑膜炎奈瑟氏菌（N. meningitidis）的唾液酸转移酶基因（nst）克隆到大肠杆菌表达载体pSTV29中，在大肠杆菌JM109体内构建了合成唾液酸乳糖的合成途径，从而合成唾液酸乳糖。利用工程菌，34℃持续发酵30 h，唾液酸乳糖的合成量为2.45 g/L。

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（责任编辑 李楠）

The Construction of E.coli Engineering Strain for Sialyllactose Production

Jin Wenbin Zhang Xiaoxiao Li Yu Lu Fuping
（Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，National Engineering Laboratory for Industrial Enzymes，Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology，the College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457）

Free sialylated oligosaccharides are known to have anti-infective and immunostimulating properties and also known to promote bifidobacterium proliferation, thus investigating the microbial synthetic route of sialylated oligosaccharides is of great value. Biosynthesis of sialyllactose involves N-acetylglucosamine-6-phosphate-epimerase（neuC）, sialic acid synthase（neuB）, CMP-Neu5Ac synthetase（neuA）and α-2, 3-sialyltransferase（nst）. We engineered a biosynthetic pathway sialyllactose production in E.coli JM109, using the expression vector pSTV29, by coexpressing the α-2, 3-sialyltransferase gene from Neisseria meningitidis with the neuA, neuB and neuC Campylobacter jejuni genes encoding CMP-NeuAc synthetase, sialic acid synthase and N-acetylglucosamine-6-phosphate-epimerase, respectively. Under the optimized fermentation conditions（inoculum volume 2%, 10g/L lactose, fermentation volume 50 mL/250 mL, temperature 34℃, rotation speed 180 r/min, fermentation time 30 h）, sialyllactose of 2.45 g/L was obtained. The above results provide a platform for exploring commercial production of sialylated oligosaccharides and its functional analogues in heterogeneous microbial hosts.

Sialyllactose E.coli Metabolic engineering

2014-05-04

国家高技术研究发展计划“863计划”资助项目（2012AA021502），教育部长江学者和创新团队发展计划项目（IRT1166）

靳文斌，男，硕士研究生，研究方向：发酵工程，E-mail：jinwenbin-1988@163.com

李玉，女，教授，研究方向：应用微生物与酶工程；E-mail：liyu@tust.edu.cn