超高效液相色谱法快速测定原料乳中的双氰胺

丁娟芳，樊艳，吕玉珍，韦林洪

（1.扬州职业大学生物与化工工程学院，江苏扬州225009；2.南京财经大学食品科学与工程学院，江苏南京210023）

超高效液相色谱法快速测定原料乳中的双氰胺

丁娟芳1，樊艳2，吕玉珍1，韦林洪1

（1.扬州职业大学生物与化工工程学院，江苏扬州225009；2.南京财经大学食品科学与工程学院，江苏南京210023）

建立了超高效液相色谱检测原料乳中双氰胺的分析方法。采用甲醇提取样品中的双氰胺，HILICS色谱柱为分析柱，流动相为乙腈-10mmol/L乙酸铵（90∶10，体积比），流速0.4mL/min，检测波长230 nm。双氰胺在0.006mg/L～10.0mg/L范围内具有良好的线性关系，标准曲线方程为y=90.336x+0.994 6，R2=0.999 9。方法检出限为0.05mg/kg，不同添加水平平均回收率在87.0%～91.6%之间，变异系数＜3.84%（n=6）。此方法操作简便，可在15min内完成快速检测，适用于原料乳中双氰胺残留的快速筛查。

超高效液相色谱；双氰胺；原料乳

双氰胺（Dicyandiamide），化学式C2H4N4，又名二氰二氨，是氰胺的二聚体。双氰胺能够抑制土壤中硝化细菌的活动，从而使氮肥在土壤中的转化速度得到调节，减少土壤中氮的流失，减少温室气体排放[1-2]。2013年1月，新西兰部分乳制品被爆检测出少量双氰胺，再次引起了人们对乳品安全的关注。现有资料显示，双氰胺本身属于低毒物质[3]，目前也还没有人或动物食用了双氰胺后导致危害的报道，但由于缺乏官方的毒理数据，其风险评估结果仍未知[4]。作为硝化抑制剂或氮肥增效剂，双氰胺广泛用于中国、美国、日本、新西兰等国家的化肥工业中。鉴于目前国内外乳制品质量安全事件频发，乳产品供应链的源头—原料奶的质量安全风险监控就必须更加全面和严格，原料奶的双氰胺含量监测和筛查就显得尤为必要。

目前，乳粉中双氰胺的测定方法已有报道，多利用液相色谱-质谱法[5-8]进行检测，硬件配置门槛较高，而原料乳中双氰胺的检测方法少见报道。本研究建立了一种高效、快速的测定原料乳中双氰胺的高效液相色谱检测方法，整个测定过程能在15min内完成，适用于检测机构、乳品工厂等单位对原料乳中双氰胺的初步筛查。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Agilent1290超高效液相色谱仪，配二极管阵列检测器（DAD）：美国Agilent公司；FA1604电子天平：上海天平仪器厂；Milii-Q超纯水机：美国Millipore公司。

双氰胺标准品（纯度99%）：美国Sigma公司；甲醇、乙腈（色谱纯）：美国TEDIA公司；乙醇、丙酮（色谱纯）：上海凌峰化学试剂有限公司；实验用水为超纯水机制备。

1.2 色谱条件

AcclaimTMHILIC-10色谱柱（2.1×150mm，3μm）；柱温：30℃；进样量：1μL；流动相：乙腈：10mmol/L乙酸铵（90∶10，体积比），乙酸铵水溶液用10%冰醋酸溶液调至pH6.0；流速：0.4mL/min；检测波长：230 nm。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液的配制

准确称取双氰胺标准品0.025 g，置于50mL容量瓶中，用甲醇定容得到500mg/L的标准储备液，用甲醇稀释标准储备液，配制成0.006、0.02、0.08、0.4、0.8、4.0、10.0mg/L的标准使用液。

1.3.2 样品的制备

称取1 g原料奶（精确至0.001 g），置于25mL具塞刻度试管中，加1mL 70℃热水混匀，加入甲醇定容至满刻度，剧烈振荡3min后静置5min，上清液经0.22μm有机系滤膜过滤，待HPLC分析。

2 结果与讨论

2.1 样品处理条件的优化

双氰胺极性较强，可溶解于水、甲醇、乙醇等极性溶剂[9]，本实验选择了甲醇、乙醇、丙酮和乙腈4种溶剂对样品中的双氰胺进行提取，样品加标量为1mg/kg，每组条件平行测定6次。加标回收率结果见表1。

表1 不同处理方法的回收率（n=6）Table1 The results of recovery of different approaches（n=6）

结果显示，甲醇提取回收率最高，且与其他提取条件差异显著（p＜0.05），故选择甲醇作为萃取溶剂。

2.2 色谱条件的优化

双氰胺是极性小分子化合物，在C18柱中几乎无保留。HILIC色谱柱基于亲水相互作用，能为强极性和亲水性化合物提供合适的保留。本实验通过标样和处理液分离效果的尝试，选择了HILIC柱作为分析色谱柱。对双氰胺的标准溶液在190 nm～400 nm范围内进行扫描，发现在218 nm处有最大吸收波长，考虑到甲醇和乙腈的紫外吸收干扰，故选择了相对红移的波长230 nm作为检测波长，并采用二极管阵列检测器对其进行光谱扫描，以保留时间和三维光谱图相似性系数进行定性。按上述波长条件，考察了不同配比的乙腈和乙酸铵水溶液作为流动相的分离效果，最终选择了乙腈-10mmol/L乙酸铵（90∶10，体积比）作为流动相。色谱图见图1～图3。

图1 双氰胺标样色谱图Fig.1 Chromatogram of Dicyandiamide

图2 空白样品色谱图Fig.2 Chromatogram of blank sample

图3 加标样品色谱图Fig.3 Chromatogram of blank sample spiked with Dicyandiamide

2.3 方法线性范围、检出限、回收率和精密度

图4 双氰胺标准曲线Fig.4 Standard curve of dicyandiamide

参照上述实验条件以标准使用液进行分析，标准物质浓度范围在0.006mg/L～10.0mg/L内，质量浓度和峰面积有良好的线性关系（图4）。方法检出限以噪声面积的三倍计算，为0.05mg/kg。在上述前处理和色谱条件下，在阴性样品中添加标样，进行不同水平的添加回收率和精密度实验，每组条件测定6次。结果显示，不同添加水平下，加标回收率均值在87.0%～91.6%之间，变异系数＜3.84%（表2）。结果表明本方法测定准确，加标回收率高，精密度好，能够很好地满足实际样品的测定。

表2 双氰胺加标回收率和精密度Table2 Recoveries and repeatability of dicyandiamide

3 结论

本文应用超高效液相色谱仪测定了原料乳中双氰胺的含量，整个检测可在15min内完成，具有快速、简便、成本低等优点，方法精密度和回收率能满足实际样品检测的要求，可实现对原料乳中双氰胺残留的快速筛查。

[1]MONAGHAN RM,SMITH LC,DE KLEIN C A M.The effectiveness of the nitrification inhibitor dicyandiamide(DCD)in reducing nitrate leaching and nitrous oxide emissions from a grazed winter forage crop in southern New Zealand[J].Agriculture,Ecosystems& Environment,2013(175)：29-38

[2]商照聪,高子勤.双氰胺对碳酸氢铵在土壤中氮素转化的影响[J].应用生态学报,1999,10(2)：183-185

[3]贾广乐,王建峰,林祥梅,等.三聚氰胺等4种物质的毒性比较研究[J].中国畜牧兽医,2008,35(12)：162-163

[4]罗季阳,杨倩,王欣,等.进口乳制品中双氰胺对人类健康的风险概述[J].食品工业科技,2013,34(9)：277-279

[5]MACMAHON S,BEGLEY TH,DIACHENK O G W,et al.A liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for the detection of economically motivated adulteration in protein-containing foods [J].Journal of Chromatography A,2012(1220)：101-107

[6]许娇娇,张京顺,黄百芬,等.液相色谱-串联质谱同位素稀释法测定奶粉中双氰胺的残留[J].食品安全质量检测学报,2013,4(2)：415-420

[7]黄芳,马叶芬,吴惠勤,等.液相色谱-串联质谱法快速测定奶粉中的双氰胺[J].分析测试学报,2013,32(3)：271-274

[8]罗海英,冼燕萍,侯向昶,等.QuEChERS-超高效液相色谱串联质谱法测定乳粉中的双氰胺[J].现代食品科技,2013,29(5)：1148-1152

[9]周靖平,金念祖.双氰胺及其测定[J].中国卫生检验杂志,2007, 17(10)：1921-1922

Rapid Determination of Dicyandiamide in Raw Milk by Ultra High Performance Liquid Chromatography

DING Juan-fang1，FAN Yan2，LÜ Yu-zhen1，WEI Lin-hong1
（1.College of Biological and Chemical Engineering，Yangzhou Polytechnic College，Yangzhou 225009，Jiangsu，China；2.College of Food Science&Engineering of NJNU，Nanjing University of Finance Economics，Nanjing 210023，Jiangsu，China）

An ultra high performance liquid chromatography method was developed for determination of dicyandiamide in saw milk.Dicyandiamide was extracted by methanol，the sample was isolated on a HILICcolumn，using a mobile phase made up of acetonitrile and 10mmol/Lammonium acetate（90∶10，V/V）at a flow rate of 0.4mL/min，and detected at 230 nm.Dicyandiamide was well separated with a good linear relation ship in the range of 0.006 mg/L-10.0 mg/L，caffeine standard curve equation:y=90.336x+0.994 6，R2=0.999 9.The detection limit was 0.05mg/kg，recovery rate was in the range of 87.0%-91.6% at several spiked levels，and the coefficient of variance of method was less than 3.84%（n=6）.This method is simple，the whole determination process was completed with in 15min，making it applicable for analysis in dicyandiamide monitoring programmes in saw milk.

ultra high performance liquid chromatography；dicyandiamide；saw milk

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.16.024

2013-11-13

丁娟芳（1981—），女（汉），讲师，硕士，主要从事食品生物技术研究。