明胶肽抗中枢疲劳作用机制的研究

薛海涛，张小强，2

（1.咸阳师范学院体育系，陕西咸阳712000；2.陕西科技大学化学与化工学院，陕西西安710021）

明胶肽抗中枢疲劳作用机制的研究

薛海涛1，张小强1，2

（1.咸阳师范学院体育系，陕西咸阳712000；2.陕西科技大学化学与化工学院，陕西西安710021）

检测饲养明胶肽与蒸馏水的大鼠进行力竭性游泳运动后即刻纹状体、间脑及下丘脑等不同部位的多巴胺和5-羟色胺含量，探讨明胶肽对多巴胺与5-羟色胺含量变化的调节及抗中枢疲劳功效，为开发高附加值的明胶活性肽产品，扩展猪皮产品的应用范围提供理论参考，同时为抗中枢疲劳提供新的营养手段。通过负重游泳训练建立动物疲劳模型，用自制的明胶肽灌胃饲养实施营养干预，用高效液相色谱方法检测不同脑区单胺类神经递质的浓度变化并计算DA/5-HT比值，分析、评价自制明胶肽对中枢递质的调节作用。和灌胃双重蒸馏水的对照组比较，饲养明胶肽的动物实验组比值为0.84，对照组为0.14，两组比较，实验组比对照组高600%，明胶肽具有明显的提高DA含量，降低5-HT生成，增强中枢兴奋性的功效，可以有效缓解中枢疲劳，增强抗中枢疲劳的能力。

明胶肽；DA/5-HT比值；中枢疲劳

运动性疲劳是发生机制复杂且作用位点众多的一种生理现象。由于传统研究方法和测量技术的限制，对运动性疲劳的研究多集中于外周肌肉疲劳方面，中枢神经系统在运动性疲劳中的作用少受重视。近年来的医学研究证明，针对不同项目和强度诱发的疲劳，运用某些单味中药、复方中药或生理活性成分，可使模型动物全脑或不同脑区5-HT、DA等单胺类神经递质及其代谢产物的浓度发生变化，尽管这些变化在程度、性质、代谢途径和分子机制等方面还不清楚，但却说明上述活性成分对调节脑内单胺类递质及其代谢具有重要作用。随着新技术的应用和神经生物学研究的发展，运动性中枢疲劳的研究已经取得某些突破性进展。目前的研究表明，长时间运动后，脑组织单胺类递质可发生改变，影响中枢的兴奋与抑制过程，这是导致运动性中枢疲劳的可能机制之一。本文拟通过对模型动物灌胃饲养明胶肽实施营养干预，研究活性肽对神经递质的调节作用和抗中枢疲劳分子机制，为抗中枢疲劳提供新的营养手段。

1　材料与方法

1.1材料

KM封闭群无菌型大白鼠50只（8周龄），180 g～220 g：购自西安交通大学动物试验中心。

1.1.2试验食品与试剂

食品级明胶：山东淄博宝恩生物科技有限公司提供；胰蛋白酶：Wolsen；明胶肽：陕西科技大学食品系分析实验室用胰蛋白酶水解明胶（酶解工艺条件：pH6.2，酶含量为4%，原料的质量浓度为4%，水解温度51℃，时间5 h；酶解液用15%TCA除蛋白，超滤膜分离、收集＜10 kDa上清液）；标准品：DA、5-HT（Sigma公司）；标准品溶液配置：以0.01mol/LHCl分别配成浓度为1 g/L的储备液，置4℃冰箱保存，临用前稀释。以DHBA为内标，浓度同上。其余为国产分析纯试剂。

1.1.3仪器和试剂

WatersTM600E高效液相色谱仪、16K进样阀、接5μL进样环、SIL-6A自动进样器、AS3120A超声去气仪；CTO-6A柱温箱；SepStikC18微柱（100mm×1mmi.d.，粒径5μm）；PM-80微流量泵、CHI832电化学检测器；5011型石墨碳工作电极、参比电极为Ag/AgCl，参比电极的电位分别设置为+0.72 V（氧化）和+0.05 V（还原），灵敏度均为5 nAFS；4.6mm×150mm色谱柱，填料5μm Hypersil BDS（大连依利特科学仪器有限公司）；检测电压为700μV，灵敏度为5 nA；Scientific software Ezchromelite分析软件；0.45μm滤膜及抽滤器（Millpore）；Biofuge28RS高速冷冻离心机（Heraens）；Soniprep150超声破碎仪（Sanyo）；0.2mGHP耐酸样品处理器（Pall）；PelletPestile电动匀浆仪（Kontes）；SN-2型立体定位仪（Narishige）。

1.2方法

1.2.1大白鼠分组饲养、日常运动训练、力竭性负重游泳实验

二是社会监督体系不健全。邓小平总结党在社会主义建设过程中过去发生的各种错误，指出这些错误的发生与我国法制不健全和社会监督制度缺失有关。因此，邓小平非常重视制度建设，认为制度在规范社会行为、完善社会监督方面具有根本性、长期性、稳定性和全局性。

按照体重随机分成2个组，对照组和试验组。且每组要多养3～5只预防灌胃或者运动训练时溺水发生意外。日常自由采食饮水，灌胃饲养28 d，灌胃时间安排在运动前2 h，对照组灌胃双重蒸馏水，试验组给予明胶肽，饲养量为动物体重的3%。每天游泳训练一次，每次20min，水深100 cm，水温（30±2）℃，不负重。末次灌胃2 h后，安排大白鼠负重3%进行游泳运动，负重方式应用食品包装膜包裹橡皮泥，再用棉线系在小鼠尾部的模式，待其头部沉入水中10 s不能自己浮出水面为力竭性疲劳，采样检测。

1.2.2样品的提取和净化

采用剪刀断头，直接取脑的方法，利用定位仪划分脑区，取出的脑组织用冰生理盐水冲洗，不但使酶活性迅速降低，而且方便脑组织的分区。实验大鼠分别于安静状态和运动疲劳后即刻断头处死，迅速打开颅腔，取出全脑，在冰面上取纹状体、海马、皮质、下丘脑、小脑和脑干等部位脑组织，用冰生理盐水冲洗后滤纸吸干，称重后用10倍的预冷100 g/L磺基水杨酸处理，置1.5mL离心管中充分匀浆，加入组织裂解液（0.01%半胱氨酸，0.2 mmol/L HClO，0.5 mmol/L EDTA），再次放置在1.5mL离心管中充分匀浆，然后超声破碎两次，离心15min（14 000 r/min，4℃）；取上清液置另一离心管中，按1：5比例加入冰冷的0.1mol/L的高氯酸溶液,低温离心30min（10 000 r/min，4℃）1次，取上清液，沉淀蛋白质后冷冻离心，将上清液置-80℃液氮冻存待测。测样品时，将样品冰上融化后离心过0.2mmol/L的耐酸过滤器。取上清液由自动进样器进样。采用高效液相色谱电化学检测多巴胺、5-羟色胺等神经递质含量。实验数据采用SPSS11.5软件进行统计、分析，P为0.05。

1.2.3样品测试

20世纪90年代生理学家把环磷腺苷（cAMP）称为第二信使；如今又把单胺类神经递质称作第三信使。单胺类递质包括儿茶酚胺类和吲哚胺类，前者研究较多和较早的有多巴胺（DA）；后者主要包括5-羟色胺（5-H T）。它们是高等动物和人类中枢神经重要的信息传递物质，准确检测其在脑组织的含量，研究其生理功能，对于判断中枢神经系统的功能和状态等具有重要的意义。但由于单胺类递质从神经元末梢释放后，迅速代谢或重摄取，使这些递质的组织收集液浓度非常低，加之自身化学性质不稳定，生物结构具有相似性，以及可能存在的内源物干扰，检测很不容易。自1978年Hallman等[1]首先报道用高效液相色谱法（HPLC）检测血浆中儿茶酚胺以来，国内外已有许多改良方法问世[2-3]。常见测定方法主要有电化学检测法、生物法、高效液相色谱荧光检测法、毛细管电泳法、气相色谱、放射示踪等，但这些方法对样品的处理比较复杂，测量成本和仪器设备的要求很高，而且耗时较多。用同样的方法一次处理样品同时测定多种神经递质的方法更是少见。Meeusen[4]等采用反相高效液相电化学色谱法（rP-HPLC-ECD）使得测定时间大大缩短，灵敏度提高。赵焕英[5]通过对样品的预处理，建立了一种能在简单配置HPLC-ECD仪上同时测定多种单胺类物质及其代谢产物的方法。叶惟泠[6]的研究证实应用微柱液相色谱-双电极电化学法检测、分析脑中的单胺类递质具有省溶剂和增加灵敏度的优点。本研究借鉴现有研究成果，经反复实验，设计以下检测方案。

1.2.3.1样品的预处理

选择有效地样品预处理方法是成功地应用高效液相色谱法测定各类神经递质的关键。经预实验最终确定0.2mol/LHClO为组织样品提取单胺类递质的蛋白变性剂；同时添加0.01%半胱氨酸和0.5mmol/L Na2EDTA，达到减少溶质被氧化破坏的目的。操作过程中为减少由研磨程度不均引起的递质含量提取差异，对组织匀浆后的样品进行适度的超声破碎；在4℃、15min（14 000 r/min）条件下离心后再用耐酸的GHP 0.2m过滤器处理。

1.2.3.2色谱条件的选择和优化

柱温：30℃；进样量：20mL；工作电位选择在0.6 V。经反复实验选择pH=5.0、浓度0.1mmol/L的柠檬酸/柠檬酸钠为缓冲液，流量为0.4 g/L；甲醇作为流动相有机剂，其中甲醇含量为8%（体积分数）；流速为1.0mL/min。考虑到单胺类递质及代谢产物的混合物用简单非梯度洗脱系统难以有效分离，本实验将1-庚烷磺酸钠加人柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液，同时为稳定pH及防止样品峰拖尾加入适量的5mmol/L二三乙胺，结果显示2种单胺类递质实现了较好的分离。多巴胺及5-羟色胺含量采用美国Waters公司的配套软件Millennium32自动控制积分测定峰面积计算、内标法定量。

2　结果分析与讨论

2.1明胶肽对DA的调节作用和抗中枢疲劳功效

DA是脑内一种重要的单胺类神经递质，血液中的Tyr进入脑内后转运至DA神经元内，主要在黑质产生。合成后的DA沿黑质-纹状体投射系统分布，储存在纹状体DA神经末稍的囊泡中。主要作用是调节肌紧张，使机体作好运动的准备，并在大脑皮质的信号刺激下“启动”某一动作，属于一种兴奋性神经递质。现代医学研究[7]表明黑质-纹状体中DA的减少会导致运动的抑制。Bailey[8]的研究表明，1 h适量运动后，大鼠脑内多部位DA及其代谢产物增加，但3 h运动至疲劳后却降低。宋亚军[9]的研究发现，大鼠一次性力竭游泳3 h运动后即刻，间脑DA显著降低。而急性耐力运动后，间脑、端脑DA浓度降低，脑干有升高趋势，DA水平变化表现出区域特异性。Chaouloff[10]的研究发现，以60%～65%VO2max运动1 h后，大鼠脑内DA水平增高；在运动至疲劳的运动中，随着疲劳的形成与发展，DA水平趋于降低；预示运动鼠脑内DA合成与代谢得以维持时，可推迟运动性疲劳的出现。整体上来说大脑DA与激发促动、肌肉协调能力及耐力运动成绩密切相关；对神经系统的电活动有兴奋作用，维持脑内较高的DA水平有助于延缓疲劳的发生[11]。本实验通过对模型动物灌胃饲养明胶肽，检测了不同脑区对这种营养干预的反应，结果如表1所示，实验组和对照组相比，不管安静态还是疲劳态，在检测的所有脑区实验组DA含量均高于对照组；但各个脑区对营养干预的反应并不一致，DA升高程度存在一定差异；运动后变化幅度也非线性降低，其中海马区反应最为敏感，实验组比对照组提高了254%；中脑、脑干的变化缺乏统计学差异；端脑、下丘脑和纹状体DA运动前后的比值含量仍旧高于对照组。提示明胶肽通过不同程度提高模型动物不同脑区的DA含量，有可能延缓疲劳的发生，端脑、下丘脑和纹状体前后反应一致。结合我们[12]前期的研究工作，明胶肽不仅具有抗外周疲劳的功效，也可能通过调节兴奋性递质水平的方式，延缓中枢疲劳的发生。

表1　大鼠不同脑组织安静态、疲劳态DA的平均值和标准差（n= 10，ng/g，x±S）Table1 Concentration of DA on the rat from the different tissue（n=10，ng/g，mean±SD）

2.2明胶肽对5-HT的调节作用和抗疲劳功效

5-羟色胺是脑内广泛存在的一种抑制性单胺类神经递质，主要作用是抑制下丘脑因子的释放，而这些因子可控制垂体激素的释放率，通过下丘脑-垂体-腺体轴的调节影响血液相应激素水平，使机体运动能力下降[13]。同时，脑内5-HT增加可降低体温调节功能、抑制心血管活动、增强嗜睡感等，而这些机能又与肌肉疲劳感密切相关；进而影响机体的运动能力，引起运动性疲劳的发生，是中枢疲劳的可能性介质[14]。Newsholme[15]研究了中枢5-HT的作用与变化，发现脑内5-HT增加能损伤长时间运动中神经系统的功能，引起运动能力的下降，并据此首次提出了“中枢疲劳”的假设。药物介导的实验表明[16]，使用5-HT促进剂可降低耐力运动成绩，引起疲劳提前出现；而5-HT拮抗剂实际上能推迟疲劳的产生。Davis[17]通过研究认为5-羟色胺可抑制多巴胺能系统，并且这种效应因为多巴胺能系统的损伤或功能减弱变得更加显著；他还进一步证实，5-HT脑部合成增加，可增强中枢神经系统对其它疲劳信号的敏感性，使机体运动能力降低。Chaouloff[10]对运动后大鼠大脑不同部位5-HT水平的实验研究发现，1 h跑台跑（20m/min）可导致中脑、海马、纹状体5-HT增加，其它脑区无明显变化；说明跑台跑可增加运动鼠特定脑区5-HT的合成与代谢。他们的研究结果显示，超长运动可使下丘脑等脑区5-HT水平提高，诱发运动性疲劳的产生。宋亚军等[9]的研究显示，3 h游泳运动后即刻，大鼠间脑和脑干5-HT浓度增高；其中，间脑5-HT质量分数增加（23.15%）显著，端脑则略有降低。表明各脑区5-HT对急性耐力运动的反应存在差异；提示，在急性耐力运动中，中枢疲劳的可能性介质（5-HT）水平的提高可能发生或首先发生在某些脑区，而非全脑，其变化情况可能与运动持续时间、运动强度及运动方式等因素有关。Blomstrand等[18]对2 h跑台运动（平均17m/min）后大鼠不同脑区的研究表明，无训练大鼠下丘脑5-HT浓度显著增高，海马、纹状体和脑干有增高趋势，而皮质和小脑表现为轻微降低，超长适量运动和力竭性运动可增加脑内各部位5-HT的合成与更新。Newsholme[19]采用微透析技术对大鼠海马5-HT变化的研究显示，从跑台跑（25m/min）60min开始5-HT表现为增加，120min的运动结束达到最高。洪煜[20]通过游泳模型采用高效液相分析检测取得了类似的结论。总之，5-HT的变化和中枢疲劳紧密相关，并具有一致性。我们的营养干预实验结果如表2所示，在安静态，明胶肽可以不同程度降低实验组动物脑内不同功能区5-HT水平，使动物保持较高的兴奋性；疲劳后，和对照组比较，实验组除皮质和端脑外，其余功能区5-HT含量同样低于对照组，尤以海马、下丘脑和纹状体差异显著，具有统计学意义。这个结果显示，明胶肽对中枢功能具有稳定功能，可以减少或延缓运动刺激带来的递质水平变化，从而产生抗中枢疲劳功效。

表2　大鼠不同脑组织安静态、疲劳态5-HT的平均值和标准差（n=10，ng/g，x±S）Table2 Concentration of 5-HT on the rat from the different tissue

2.3明胶肽抗中枢疲劳机制的分析

中枢系统作为自然界最复杂的反馈和控制系统，特异性功能神经元细胞在脑内的分布广泛重叠，动态联系；依据泛脑网络理论，中枢系统的特定功能区可以定位在相对间隔的一定部位；也可能呈序列排布的网状分子结构；这种多级神经元间的序列排布可引起递质之间纷繁的生理效应等[7]。目前的研究[11]发现纹状体、中脑及下丘脑内不仅含有较为广泛的单胺类神经元，纹状体与中脑黑质及下丘脑还存在着传入、传出联系；现有研究表明纹状体是控制、调节运动的一个重要中枢，下丘脑与行为的适应密切相关；它们所释放的递质多巴胺、5-羟色胺可能互相影响，互相制约，支配着中枢的相同或不同的部位，伏隔核后部的5-HT受体的激活可刺激DA的释放，而纹状体的5-HT可抑制DA能系统。另一方面，虽然通过实验发现[21]，中枢5-HT和DA等递质浓度变化是影响运动性疲劳的重要神经生物学因素，但多数报道只是对局部脑区，或者是某些神经功能团进行研究。因此，对运动中单胺类递质变化的认识应从不同层次、不同水平加以整和，以求更全面地理解中枢疲劳的形成机制。

单胺类递质从突触前膜释放后，主要是通过重摄取而灭活。给大鼠食用5-羟色胺重摄取抑制剂氯米帕明后，发现纹状体多巴胺活性水平升高，说明5-羟色胺含量的升高，可以促进多巴胺的重摄取作用[22]。王斌[23]的实验表明不管是力竭运动后即刻，还是在运动后24 h，中脑和下丘脑DA的变化是相同的；下丘脑内的5-HT水平的变化与DA的变化有相反的趋势，预示下丘脑的活动可能受DA和5-HT共同抑制。更多研究[24]表明，纹状体中的DA的增加，与中脑和大脑皮质中5-HT增加相伴发生。类似的实验[25]显示中脑多巴胺/5-羟色胺比值在运动后即刻升高，运动后下降，运动后即刻及运动后下丘脑多巴胺/5-羟色胺比值持续保持较低水平，提示运动后即刻中脑处于兴奋状态，下丘脑则可能是一种持续的抑制。疲劳时，5-羟色胺含量在运动后比安静时显著升高，在纹状体和中脑疲劳的延续期升得更高。脑中的多巴胺在运动后即刻显著升高，在之后逐渐降低。这些研究表明脑内的高多巴胺/5-羟色胺比值可能通过增加唤醒动机、提高神经肌肉的兴奋性和协调性等增强行为能力；而低多巴胺5-羟色胺比值可能通过减弱促动作用、降低运动动机、诱发心理疲倦、导致失眠等降低行为能力，即构成中枢疲劳。因此，有学者研究用它们之间的比值来分析它们之间的关系。正常机体的运动调节有赖于DA和5-HT的平衡。

运动性疲劳是一个外周与中枢协同交互作用的复杂过程，其中一类神经递质的变化并不能很好地反映中枢的兴奋与抑制状态。研究发现，超长运动中所产生的疲劳与脑内5-HT增加和DA降低相关[26]。所以，我们采用DA/5-HT比值来描述二者在运动疲劳形成和发展过程中的可能关系，结果如表3所示，虽然大鼠各个脑区DA、5-HT的代谢状况、运动前后的变化程度等并非完全一致。其中明胶肽的干预效果在端脑、间脑、下丘脑、纹状体等部位表现更加显著；提示纹状体等部位可能是长时间运动中枢疲劳的敏感性区域；即长时间耐力运动可能会首先引起纹状体单胺类递质的变化，造成运动能力的降低，并引起运动性疲劳的形成与发展。但总体而言，各个脑区的DA/5-HT比值，不管是安静态还是疲劳肽均是实验组高于对照组。显示明胶肽可能通过协调不同递质的代谢水平，减少或延缓神经递质的剧烈变化，稳定中枢功能的稳态达到抗中枢疲劳的功效。

3　结论

许多学者认为，运动性疲劳的产生可能与运动类型有关，短时间剧烈运动时出现的疲劳往往与疲劳的外周机制相关；而长时间中等强度运动产生的疲劳，则以中枢系统的保护性抑制为主。本实验结果说明在运动性疲劳的发生过程中神经系统不同部位的调控发挥着特定作用，与现有结果一致。从单胺类神经递质的变化看，大鼠中枢系统的抑制与纹状体、脑干和下丘脑等部位DA和5-HT含量的变化联系密切，运动导致的中枢系统的抑制在不同部位并非完全一致，这个过程可能首先发生在某些脑区，而不是在全脑均衡发生的。多巴胺和5-羟色胺在某些脑区有相对的独立性，但更多的则是同时起作用，正常的运动有赖于单胺类神经递质及其它多种递质的功能平衡。其中多巴胺和5-羟色胺之间的平衡可能是维持耐力运动能力的重要因素，通过稳定它们之间的平衡可有效削弱疲劳的发生。

表3　各组实验大鼠运动前后不同脑区DA/5-HT比值Table3 Value of DA/5-HT in rat

依据目前的研究成果，不少学者通过补充支链氨基酸、糖类、牛黄酸、不饱和脂肪酸等营养手段和方法来推迟运动能力下降和延缓运动性疲劳的产生；对于补充活性肽延缓中枢疲劳还少有研究，通过我们的实验，对模型动物补充明胶肽后，各脑区DA分解代谢水平普遍提高，以海马区提高最为明显，而5-HT的变化与DA比较并不一致。为深入探讨单胺类递质之间的相互关系以及对疲劳的影响，我们进一步观察了不同脑区运动前后DA/5-HT比值的变化。实验显示当运动性疲劳发生时，全脑的DA/5-HT比值降低，脑内的抑制过程占优势，并伴有中枢疲劳的发生。细化分析，DA/5-HT比值海马、下丘脑和纹状体等部位显著性降低，提示上述部位可能是长时间耐力运动中枢疲劳的敏感性区域，可考虑将DA/5-HT比值作为研究和评定运动性中枢疲劳的客观指标之一，同时在抗疲劳食品研发中可添加明胶肽增强功效。

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[26]Mark D J.Possible mechanisms of central nervous system fatigue during exercise[J].Med Sci Sports Exerc,1997：16(4)：45-57收稿日期：2013-10-20

Study to Gelatin Peptide on Anti-fatigue of Central Nervous System

XUE Hai-tao1，ZHANG Xiao-qiang1，2
(1.Depertment of P.E.Xianyang Normal University，Xianyang 712000，Shaanxi，China；2.College of Chemistry& Chemical Engineering Shaanxi University of Science and Technology，Xi'an 710021，Shaanxi，China）

This study was designed to observe the changes of DA and 5-HT in hypothalamus，diencephalon，corpus striatum of rats．We want to screen the effect of anti-fatigue active peptides，and the adjustability to content of DA and 5-HT.To develop the high value-added products of pigskin gelatin bioactive peptide，expanse the scope of application of the product，at the same time to provide experimental data for the method of nutrition recovery.We established animal fatigue model for load swimming training，feed gelatin peptide to mice for nutrition intervention，use the microdialysis technique to extract central neurotransmitters from fatigue animal midbrain，use reversed phase high performance liquid chromatography to detect the changes of monoamine neurotransmitter concentration and calculate the ratio of DA/5-HT.Finally，we evaluated self-made gelatin peptide to delay and moderate of central fatigue.Result of experiment:Compare to control group of feeding double distilled water，DA/5-HT of animal experimental group was 0.84，control group was 0.14.Comparison of these two groups，the experimental group was 600% higher than the control group.Gelatin peptide had obviously increased the content of DA，decreased generation of5-HT，enhanced the effect of central excitatory，alleviated the central fatigue and enhanced the ability of anti-fatigue sport.

gelatin peptide；DA/5-HT；central fatigue

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.16.002

咸阳师范学院专项科研基金项目（13XSYKY065，13XSYKY062）

薛海涛（1979—），男（汉），讲师，硕士，研究方向：体育教学与训练。