乳酸菌发酵法检测鲜乳和乳粉中的两种抗生素残留

樊璐，李宏梁，*，唐欣，张莉，樊成，刘倩，黄峻榕

（1.陕西科技大学生命科学与工程学院，陕西西安710021；2.陕西省产品质量监督检验研究院，陕西西安710048）

乳酸菌发酵法检测鲜乳和乳粉中的两种抗生素残留

樊璐1，李宏梁1，*，唐欣2，张莉2，樊成2，刘倩1，黄峻榕1

（1.陕西科技大学生命科学与工程学院，陕西西安710021；2.陕西省产品质量监督检验研究院，陕西西安710048）

根据抗生素能抑制乳酸菌发酵的原理，建立了用乳酸菌发酵检测鲜乳及乳粉中青霉素和头孢噻呋残留的方法。通过向无抗乳中添加抗生素，接种乳酸菌，测定发酵过程中的pH，得出两种抗生素的检测限。结果表明：以鲜乳为本底时，青霉素和头孢噻呋的检测限分别为0.08U/mL、0.08μg/mL；以乳粉为本底时，青霉素和头孢噻呋的检测限分别为0.1U/mL、0.08μg/mL。该方法简单、快速、价格低廉，适于推广。

乳酸菌法；乳及乳粉；抗生素残留；pH；检测限

抗生素是细菌、霉菌或其他微生物的代谢产物或人工合成的类似物，通俗地讲，抗生素就是用于治疗各种细菌感染或抑制致病微生物感染的药物。乳中抗生素残留的原因，主要是畜牧业在治疗牲畜疾病时滥用抗生素；其次是在饲料中以长期小剂量的方式添加抗生素；第三是为了防止乳酸败、延长保质期而有意添加[1]。乳中抗生素残留，不仅严重影响酸乳的生产（抗生素对乳酸菌有抑制作用），而且人长期饮用含抗生素的乳品后，抗生素在人体内不断积累，可能导致人体产生过敏反应，肠道细菌产生一定的耐药性等[2]，更加严重的，如氯霉素，会导致再生障碍性贫血和粒细胞缺乏症[3]，危害身体健康。

目前抗生素的检测方法大体分为微生物法、理化法和免疫学法[4]。理化法由于设备昂贵、过程复杂、费用较高，一般用于单一抗生素检测；免疫学法因检测范围局限且费用昂贵而不易推广。实践表明，凡是能够发酵酸乳的乳源都是来自未得乳房炎等疾病，未注射消炎针和防疫针的健康乳牛，反过来，乳酸菌不能在有抗牛乳中发酵酸乳。因此，从理论上讲，通过乳酸菌发酵实验能够证明某种乳源是否适合于发酵酸乳，从而证明该乳源是无抗还是有抗，也从而可以证明该乳源是否含有对乳酸菌有足够抑制作用的抗生素。本实验方案为首先在无抗乳中人为添加两种兽用抗生素，然后进行乳酸菌发酵实验，最后通过测定发酵乳pH的变化得出该两种抗生素对乳酸菌完全抑制的最小浓度，从而建立乳酸菌发酵过程中pH变化与乳中抗生素残留量之间的关系。本研究结果将为乳酸菌发酵法鉴别有抗乳提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株

乳酸菌YO-MIXTM499 LYO：丹尼斯克（中国）有限公司。

1.1.2 药品

青霉素（纯度93.9%）：中国药品生物制品检定所；混感头孢王（相当于头孢噻呋0.5 g/支）：合肥爱瑞特生物制药有限公司。

1.1.3 材料

无抗生素脱脂乳粉：陕西省产品质量监督检验所提供；鲜牛乳，乳粉：市售；所用材料经国家标准方法[5]检测抗生素残留为阴性。

1.1.4 试剂

2，3，5-氯化三苯四氮唑（4%）（AR）：上海远帆助剂厂；磷酸二氢钾（AR）、磷酸二氢钠（AR）：天津市天力化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

HH-2型电热恒温水浴锅：北京科伟永兴仪器有限公司；SG2酸度计（pH计）：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；MLS-3780不锈钢手提式压力蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂；SPX-150B（F）生化培养箱：上海瑞丰仪器仪表有限公司。

1.3 溶液的配制

1.3.1 灭菌脱脂乳

无抗生素脱脂乳粉适量，以蒸馏水10倍稀释，加热至完全溶解，115℃灭菌20min。

1.3.2 无菌磷酸盐缓冲液（pH为7.3±0.1）[5]

准确称取磷酸二氢钠2.83 g，磷酸二氢钾1.36 g，蒸馏水1 000mL，调节pH为7.3±0.1，121℃高压灭菌20min，冷却后置冰箱保存备用。

1.3.3 不同浓度抗生素的配制

精密称取样品（青霉素标准品3.850 8mg、头孢噻呋1.050 0mg），溶于无菌磷酸盐缓冲液中，使其浓度稀释为100U/mL～1000U/mL或者100μg/mL～1000μg/mL，再将该溶液用灭菌的无抗脱脂乳稀释至所需浓度，分装于无菌试管中，密封备用。

1.4 方法

1.4.1 测试菌液的制备

原料乳经过验收，在90℃灭菌10min[6]，迅速冷却到37℃以下，加入适量冻干乳酸菌粉，搅拌15min，封装，42℃培养4 h待用。将发酵好的酸乳按1∶1加入灭菌无抗脱脂乳进行稀释，备用。

1.4.2 检测限的测定

量取鲜乳或乳粉复原液（检测前将乳粉用去离子水复原）适量分别加入到试管中，90℃灭菌10min，迅速冷却到37℃以下，加入不同浓度梯度的抗生素和测试菌液（接种量为总量的10%[7]），样品总量为30mL，测定初始pH，然后放入42℃水浴培养1.5 h，期间每隔30min测一次pH[8]，每个梯度做3个平行实验，同时测定空白对照样，分析数据。

1.4.3 市售乳样品的测定

为了验证此方法的实际应用效果，对市场上不同的液态奶和奶粉进行抽样检测，其中鲜乳共35种，乳粉共12种。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌发酵时间的选择

在相同温度下，以鲜乳和乳粉为本底，加入乳酸菌发酵。在发酵的不同时间段分别测定pH，确定发酵时间。每组做三个平行样和一个阳性对照样，鲜乳和乳粉的编号依次为1-6。结果如表1所示。

表1 发酵乳样品在乳酸菌发酵不同时间的pH变化Table1 The pH variation of fermented milk samples at different time during lactic acid bacteria fermentation

从表1可以看出，无抗生素的乳样本底随着乳酸菌发酵时间的增加，pH依次降低，说明乳酸菌发酵正常。添加抗生素的（阳性）乳样本底在前60min，pH依次降低；60min之后，pH基本保持不变，说明乳酸菌的生长受抑制。发酵90min后，与初始pH相比，发酵活性正常时，发酵乳样的pH明显下降，降低值大于0.3；发酵活性不正常时，发酵乳样的pH的降低值小于0.3。因此，为了在短时间能快速得出结论，确定选择发酵时间为90min，与初始值相比，pH降低值小于0.3作为抗生素存在的判断依据。

2.2 抗生素对乳酸菌发酵的抑制

对实际含有青霉素浓度为0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 U/mL[9]，头孢噻呋浓度为0.08、0.1、0.2、0.4μg/mL[10]的本底（分别为鲜乳及乳粉）样品进行检测，检测结果见表2和表3。

表2 不同浓度的青霉素对发酵酸乳样品pH的影响Table2 The impact of different concentrations of penicillin on pH of fermented milk samples

表3 不同浓度头孢噻呋对发酵酸乳样品pH的影响Table3 The impact of different concentrations of ceftiofur on pH of fermented milk samples

从表2可以看出，与空白对照相比，以鲜乳为本底时，浓度为0.02、0.04、0.06、0.08U/mL的青霉素对乳酸菌有抑制作用，但不明显，90min时pH的降低值都大于0.3；浓度为0.1 U/mL青霉素对乳酸菌的抑制程度很大，90min时pH的降低值小于0.3。说明当青霉素浓度大于0.08 U/mL时，对鲜乳中乳酸菌有明显的抑制作用。

以乳粉为本底时，浓度为0.1U/mL的青霉素对乳酸菌有抑制作用，但不明显，90min时pH的降低值大于0.3；浓度为0.2、0.4、0.6、0.8U/mL的青霉素对乳酸菌抑制作用很大90min时pH的降低值小于0.3。说明当青霉素浓度大于0.1U/mL时，对乳粉中乳酸菌有明显的抑制作用。

从表3可以看出，与空白对照相比，以鲜乳为本底时，浓度为0.08μg/mL的头孢噻呋对乳酸菌抑制作用很小，90min时pH的降低值大于0.3；浓度为0.1、0.2、0.4μg/mL的头孢噻呋对乳酸菌抑制作用很大，90min时pH的降低值都小于0.3。说明当头孢噻呋浓度大于0.08μg/mL时，对鲜乳中乳酸菌的发酵有明显的抑制作用。

以乳粉为本底时，浓度为0.08μg/mL的头孢噻呋浓度对乳酸菌抑制作用很小，90min时pH的降低值大于0.3；浓度为0.1μg/mL时，抑制作用开始变的明显；浓度为0.2、0.4μg/mL的头孢噻呋对乳酸菌抑制作用很大，90min以后pH的降低值都小于0.3。说明当头孢噻呋浓度大于0.08μg/mL时，对乳粉中乳酸菌有明显的抑制作用。

2.3 对市售乳样品的检验结果

对抽取的市售35种鲜乳和12种乳粉，分别采用乳酸菌发酵法和国标方法进行抗生素残留的检测，结果见表4。

表4 市售乳样品的抗生素残留测定结果Table4 The antibiotic residues detection results of commercial milk samples

从表4可以看出，用乳酸菌发酵法检测市售乳样品（鲜乳和乳粉共37种）中抗生素残留的结果和国家标准方法[5]的检测结果一致。与国标法相比，乳酸菌发酵法对鲜乳和乳粉中青霉素和头孢噻呋残留的检测更简单和快速，且价格低廉，适于推广。

3 结论和小结

本实验研究建立了用乳酸菌发酵检测鲜乳及乳粉中青霉素和头孢噻呋残留的方法，确定了乳酸菌发酵法用于检测鲜乳及乳粉中抗生素残留的检测限。以鲜乳为本底时，青霉素和头孢噻呋的检测限分别为0.08U/mL、0.08μg/mL；以乳粉为本底时，青霉素和头孢噻呋的检测限分别为0.1U/mL、0.08μg/mL。应用该方法对市售随机抽查样品的检测结果，与国家标准方法的检测结果一致。该方法的检测时间从传统微生物法（即国标法）的3 h～5 h缩短至2 h，而且操作更简单，价格更低廉，不需要特殊设备。

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[5]GB/T4789.27-2008食品卫生微生物学检验鲜乳中抗生素残留检验[S].中华人民共和国卫生部,中国国家标准化管理委员会,2008

[6]谢爱英,党亚丽,李芳芳,等.不同巴氏杀菌条件对酸乳品质的影响[J].食品科学,2011,32(9)：14-17

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Determination of Two Antibiotic Residues in Milk and Milk Powder by the Method of Lactic Acid Bacteria Fermentation

FAN Lu1，LI Hong-liang1，*，TANG Xin2，ZHANG Li2，FAN Cheng2，LIU Qian1，HUANG Jun-rong1
（1.College of Life Science and Engineering，Shaanxi University of Science and Technology，Xi'an，710021；Shaanxi，China；2.Shaanxi Institute of Product Quality Supervision and Inspection，Xi'an，710048，Shaanxi，China）

Lactic acid bacteria fermentation can be restricted by antibiotics.The method of lactic acid bacteria fermentation for determination of two antibiotic（penicillin and ceftiofur）residues in milk and milk powder was established.The detection limits of two antibiotics were obtained by adding antibiotics to non-anti-milk，inoculating lactic acid bacteria and determining pH during fermentation.The results showed that，when milk was used as background，detection limits of penicillin and ceftiofur were 0.08 U/mL and 0.08μg/mL，when milk powder was used as background，detection limits of penicillin and ceftiofur were 0.1U/mL and 0.08μg/mL.This method is simple，rapid，and inexpensive，and suitable for promotion.

lactic acid bacteria；milk and milk powder；antibiotic residues；pH；detection limit

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.16.023

2014-01-13

樊璐（1988—），女（汉），硕士，研究方向：食品微生物。

*通信作者