促血小板生成素对大鼠脑缺血再灌注脑组织的保护作用

邹成林 陈维钧 孙晓顺 方璟 涂军 赵亚洲

促血小板生成素对大鼠脑缺血再灌注脑组织的保护作用

邹成林 陈维钧 孙晓顺 方璟 涂军 赵亚洲

目的探讨促血小板生成素对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后的保护作用及机制。 方法 采用线栓法阻断大鼠大脑中动脉血流制成局灶性脑缺血再灌注损伤模型。将60只雄性SD大鼠随机分成促血小板生成素（TPO）组、缺血再灌注组、假手术组和正常组。于缺血开始时TPO组给予TPO 5μg／kg腹腔注射；缺血再灌注组给予等剂量生理盐水。分别于再灌注6、12、24、48 h后断头取脑、切片，进行HE染色、Bcl⁃2免疫组化染色和细胞凋亡检测。结果缺血再灌注后，TPO组和缺血再灌注组大鼠缺血侧皮层可检测到凋亡细胞，且TPO组凋亡细胞数明显少于缺血再灌注组，差异有统计学意义（P＜0.05），而假手术组及正常组未检测到凋亡细胞；TPO组和缺血再灌注组缺血侧皮层Bcl⁃2阳性细胞数均高于假手术组及正常组，与缺血再灌注组相比，TPO组Bcl⁃2蛋白表达显著增高，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论TPO可抑制缺血再灌注损伤后缺血侧皮层的细胞凋亡，其机制可能是通过上调Bcl⁃2基因表达而实现。

促血小板生成素；缺血再灌注损伤；细胞凋亡；Bcl⁃2

脑缺血再灌注损伤是急性脑血管病病理生理改变的一个重要方面，有效减轻脑缺血再灌注损伤具有重要的临床意义。促血小板生成素（TPO）是调节血小板和巨核细胞系最主要的造血生长因子［1］。近年研究发现，TPO不仅参与造血的调控，对神经系统也具有保护作用，它们通过动员骨髓的内源性干细胞，或通过其抗凋亡作用，参与损伤神经组织的修复，在不同种类的神经损伤中发挥神经营养和保护功能。杨默等［2］于2005年首次证实神经系统中存在TPO受体（C⁃mpl），能促经神经细胞生长，对抗细胞凋亡。本实验观察TPO对大鼠脑缺血再灌注损伤后缺血侧皮层Bcl⁃2的表达及细胞凋亡的影响，探讨TPO发挥神经保护作用的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠60只，体质量250～290 g，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。10%水合氯醛、SABC试剂盒、DAB显色剂（武汉博士德）；原位末端标记技术（TUNEL）检测试剂盒（北京中杉公司），抗Bcl⁃2抗体、尼龙线直径2.3 mm（日本伊东公司），Olympus实体显微镜、计算机图像分析软件，重组人血小板生成素注射液（沈阳三生制药股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 动物模型制备及分组：将大鼠随机分为正常组（6只）、假手术组（6只）、缺血再灌注组（24只）、TPO组（24只），观察点为再灌注后6 h、12 h、24 h、48 h。采用Longa等［3］的大脑中动脉线栓法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型。TPO组于再灌注开始时经腹腔注射TPO 5μg／kg，缺血再灌注组注人等量生理盐水，正常组及假手术组大鼠不进行缺血再灌注处理。

1.2.2 免疫组化染色检测Bcl⁃2蛋白表达：各组大鼠断头处死取脑组织，常规固定、石蜡包埋、切片，进行SABC法免疫组化染色。胞浆有棕褐色颗粒者为阳性细胞。每张切片在缺血区随机计数5个高倍镜视野（×400）中的阳性细胞数，取平均值为Bcl⁃2阳性细胞数。

1.2.3 细胞凋亡检测：按照原位TUNEL试剂盒说明书操作。结果判定：细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，计数凋亡细胞数。每张切片在缺血区随机计数5个高倍镜视野（×400）中的阳性细胞数，取平均值为凋亡细胞数。

1.3 统计学处理 采用SPSS 15.0软件进行统计学分析。数据以均数±标准差（s）表示，计量资料比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HE染色 缺血再灌注组缺血2 h再灌注24 h后，大鼠缺血侧大脑半球明显肿胀，TPO组缺血侧大脑半球肿胀较轻。脑组织切片HE染色显示：正常组及假手术组皮层无坏死细胞，神经元数量多；缺血再灌注组皮层缺血中心神经元数量稀疏，并可见大量变性及坏死的神经细胞；TPO组神经细胞变性坏死数量少，病变轻。

2.2 原位细胞凋亡检测结果 缺血再灌注组缺血侧可见较多的阳性细胞，假手术组偶见个别阳性细胞，正常组未见阳性细胞。TPO组缺血区阳性细胞数目减少，与缺血再灌注组相比有显著性差异（P＜0.05）。见表1。

表1 缺血再灌注组和TPO组凋亡细胞数比较（s，个／视野）

表1 缺血再灌注组和TPO组凋亡细胞数比较（s，个／视野）

注：与缺血再灌注组比较，∗P＜0.05

组别样本数（个）凋亡细胞数TPO组24 45.30±7.67∗缺血再灌注组24 67.50±9.37

2.3 Bcl⁃2免疫组化染色结果 缺血再灌注组大鼠缺血周边区可见较多阳性细胞表达，与正常组相比，有显著性差异（P＜0.05）。缺血再灌注组及TPO组大鼠再灌注6h时Bcl⁃2表达增加，24 h达峰值，之后表达出现下降；与缺血再灌注组比较，TPO组各时间点Bcl⁃2阳性细胞均明显增加，且差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 大鼠脑缺血再灌注损伤后各时间点Bcl⁃2阳性细胞数的比较（s，个／视野）

表2 大鼠脑缺血再灌注损伤后各时间点Bcl⁃2阳性细胞数的比较（s，个／视野）

注：与缺血再灌注组比较，∗P＜0.05；与正常组比较，△P＜0.05

组别6 h 12 h 24 h 48 h TPO组50.25±6.59∗△60.36±8.79∗△78.70±9.79∗△68.36±9.20∗△缺血再灌注组35.68±5.89△42.25±6.68△55.40±9.39△50.40±8.39△假手术组12.40±2.85 13.40±3.83 14.40±4.75 13.40±3.76正常组11.40±1.93 12.40±3.85 13.40±5.55 12.40±2.26

3 讨论

缺血再灌注损伤是一个复杂的病理生理过程，包括缺血后损伤过程和再灌注后的损伤过程。脑缺血后神经元死亡是一个极其复杂的病理过程。本实验中原位细胞凋亡检测结果显示缺血再灌注组及TPO组缺血侧可见较多的阳性细胞，表明细胞凋亡参与缺血再灌注损伤过程。近年来许多学者从形态学、分子生物学等方面研究证实，细胞凋亡参与脑缺血再灌注损伤。

TPO是一种造血正调控因子，可刺激巨核细胞增殖分化、成熟和血小板生成，TPO在脑缺血后脑保护中的作用机制目前尚不十分清楚。有研究认为，TPO对神经细胞有促进生长和抗凋亡的作用［4］。本实验发现，TPO组缺血脑组织HE染色神经细胞变性坏死数量少，病变轻，同时缺血再灌注组缺血侧可见较多的阳性细胞，TPO组缺血区阳性细胞数目减少，与缺血再灌注组相比有显著性差异（P＜0.05）。说明TPO能保护缺血神经元。TPO是调节巨核细胞增殖、分化、成熟和介导血小板生成的造血因子，它的生物学效应由其受体C⁃Mpl介导，通过调节干细胞中AKT和STAT等蛋白的磷酸化，从而调节细胞增殖及凋亡［5］。同时有研究发现，TPO可以通过C⁃mpl受体介导激活内皮细胞合成血小板激活因子并通过STAT信号通路诱导血管生成［6］。Perlingeiro等［7］在最近的研究中首次在成血管细胞中检测到C⁃mpl的表达，TPO可支持成血管集落形成细胞的生长，促进成血管细胞增殖，实验同时证实TPO能明显减少缺血再灌注损伤诱发的细胞凋亡。

本研究表明，缺血再灌注组Bcl⁃2阳性细胞表达在各时间点与假手术组相比差别有统计学意义，TPO组在各时间点与缺血再灌注组相比差别有统计学意义。Bcl⁃2是抑制凋亡的重要基因，本实验发现TPO组Bcl⁃2蛋白表达增加，细胞凋亡数减少，提示TPO能减少大鼠脑缺血侧大脑细胞凋亡，其减少细胞凋亡的机制可能通过上调Bcl⁃2表达来实现。Hong等［8］研究表明，脑缺血后上调Bcl⁃2表达的治疗，可缩小梗死面积。其动物实验表明，缺血8 h之内Bcl⁃2表达不明显，之后随着时间的延长，Bcl⁃2表达增高，24 h达到高峰，这与本实验研究结果一致。Plesnila等［9］研究证明，Bcl⁃2家族与脑缺血时神经元和星形胶质细胞的死亡有紧密关系，应用干预因素可上调Bcl⁃2的表达，减小梗死面积。李虹等［10］研究也发现，缺血预处理使缺血脑组织Bcl⁃2蛋白表达增强，抑制凋亡细胞产生。

综上所述，给予TPO，可使大鼠脑缺血再灌注损伤区神经细胞凋亡数量减少，其保护作用可能是通过上调Bcl⁃2减少细胞凋亡来实现的。但是由于脑缺血再灌注后神经细胞损伤受到多种基因的调控，TPO还可能通过调控其他基因及其信号转导通路发挥保护作用，这还待进一步研究。

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Protective effects of thrombopoietin on cerebral ischem ia⁃reperfusion in rats

ZOU Cheng⁃lin，CHENWei⁃jun，SUN Xiao⁃shun，FANG Jing，TU Jun，ZHAO Ya⁃zhou．Department of Internal Medicine，the Second People's Hospital of Jingzhou，Jingzhou 434000，China

ObjectiveTo study the protective effects and themechanism of thrombopoietin（TPO）on cerebral is⁃chemia⁃reperfusion in rats.M ethodsThread embolism was performed to establish cerebral ischemia⁃reperfusionmodel in rats.Sixty SD ratswere divided into TPO group，ischemia⁃reperfusion group，sham⁃operation group and normal group ran⁃dom ly.The TPO was given to TPO group at the beginning of ischemia at a dose of 5μg／kg；Ischemia⁃reperfusion group was given isodose physiological saline.6 h，12 h，24 h and 48 h after reperfusion，the ratswere executed and the brain tis⁃sues were cut into sections for HE staining and theimmunohistochemical staining to detect Bcl⁃2 and apoptosis.ResultsAfter ischemia⁃reperfusion，the apoptotic cellswere detected in TPO group and ischemia⁃reperfusion group in lateral cortex of rats，and the apoptosis cell number of TPO group was obviously less than thatof ischemia⁃reperfusion group（P＜0.05）. While no apoptotic cells were detected in sham⁃operation group and normal group.The number of Bcl⁃2 positive cells in TPO group and ischemia⁃reperfusion group was higher than that in control group and normal group.Expression of Bcl⁃2 pro⁃tein in TPO group was significantly higher than that in ischemia⁃reperfusion group（P＜0.05）.ConclusionsTPO can inhibit cell apoptosis of ischemia lateral cortex after ischemia⁃reperfusion injury，and themechanism may be through raising the expression of Bcl⁃2 genes.

thrombopoietin；ischemia⁃reperfusion injury；apoptosis；Bcl⁃2

R 973

A

10.3969／j.issn.1003⁃9198.2014.01.013

2013⁃06⁃25）

434000湖北省荆州市，荆州市第二人民医院内一科