改良直接贴壁法体外分离培养兔骨髓间充质干细胞及其鉴定

丁 晨，张仲文，聂庆虎

改良直接贴壁法体外分离培养兔骨髓间充质干细胞及其鉴定

丁 晨1，张仲文2，聂庆虎2

目的观察并鉴定兔骨髓间充质干细胞生物特性，建立一套简单、高效的培养方法。方法采用直接贴壁法分离培养兔骨髓间充质干细胞，倒置显微镜下观察其形态。MTT法测定其增殖水平并绘制其生长曲线。流式细胞仪测定第三代骨髓间充质干细胞表型。结果细胞培养第5 d，镜下见细胞呈小集落生长，形态呈多边形；7～8 d小集落融合成大集落，10 d左右可传代。第二代细胞镜下呈梭形成纤维样细胞，即间充质干细胞；细胞生长曲线成S形；流式细胞仪检测细胞表达CD 73、CD 90、CD 105、不表达CD 34、CD 45。结论改良直接贴壁法可获得大量、纯化、稳定的间充质干细胞。

直接贴壁法;兔;骨髓间充质干细胞

骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)是一类存在于骨髓中、具有高度自我更新和多向分化潜能的干细胞[1]。在一定条件下，BMSCs能分化成软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞等[2]。BMSCs来源广泛，容易获得，易于培养，如今已成为组织细胞工程领域内常用的种子细胞[3～5]。本研究旨在探索兔BMSCs体外分离、培养、纯化和增殖的最佳条件，并进行相关检测。

1 材料与方法

1.1 实验动物 4～5个月龄健康新西兰大耳兔8只，普通级，体重2.0～3.0 kg，雌雄不限，由解放军总医院提供。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 试剂 DMEM/F12 培养液(HyClone)；胰蛋白酶(GiBco)；胎牛血清(HyClone)；四甲基偶氮唑盐(MTT，Sigma)；二甲基亚砜(DMSO，Sigma)；青-链霉素双抗(HyClone)

1.2.2 仪器 CO2恒温培养箱(上海)；双人单面超净工作台(安泰VS-1300L-U)；低温高速离心机(美国贝克曼J-26XP)；恒温振荡培养箱(中国，THZ-95)；普通光学显微镜(日本奥林巴斯)；倒置荧光显微镜(日本奥林巴斯)；酶标仪(美国贝克曼DTX-880)

1.3 方法

1.3.1 BMSCs的分离和原代培养 取新西兰大耳兔1只，称重后全身麻醉，固定于手术台上，髂骨处备皮、消毒，无菌条件下使用16号骨髓穿刺针于髂骨处穿刺，用5 ml无菌注射器(内含3000 U肝素)抽取骨髓约4 ml。将抽取的骨髓全部移入15 ml离心管中，加入等量PBS混匀，以1500 r/min离心3 min，弃去上清，约有2 ml的骨髓沉淀，加入5 ml含10%胎牛血清的DMEM/F12培养(0.07 ml， 0.01 U/ml的青链霉素)，充分吹打均匀，接种于25 cm2培养瓶中，置37 ℃，体积分数为5% CO2及饱和湿度培养箱中培养。第3天半量换液，第5天全量换液，并用PBS轻轻震荡清洗1次，去除杂质。以后每2～3 d半量换液一次。

1.3.2 BMSCs的传代和扩增 原代培养10 d左右，倒置显微镜观察到BMSCs生长融合达到80%～90%。弃去全部培养，PBS冲洗2次，用2 ml 0.25%胰蛋白酶消化2～3 min，倒置显微镜观察到细胞形态开始皱缩，间隙增大，呈漂浮状态时加入3 ml培养基终止消化，轻轻吹打数次，以1300 r/min离心3 min，弃上清，加入10 ml含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，以1∶2传代培养，分别记为A瓶和B瓶，A瓶培养基中不添加双抗，B瓶培养基中添加0.05 ml(0.01 U/ml)的青链霉素。A瓶换液及其传代所用培养基都不再添加抗生素，记为无抗生素组；B瓶换液及其传代所用培养基添加抗生素，记为抗生素组。每2 d或3 d半量换液1次，倒置显微镜观察细胞形态并做记录。

1.3.3 BMSCs生长曲线的测定 MTT法测定兔BMSCs的生长曲线：取生长达80%～90%融合的第3代MSCs，0.25%胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液，1300 r/min离心5 min，以2×104/ml的密度接种于96孔板，每孔接种100 μl，置37 ℃，体积分数为5% CO2及饱和湿度培养箱中培养。每天固定时间取出96孔板，选择其中12孔加入MTT 10 μl，37 ℃培养4 h后吸出上清并加入150 μl DMSO，置脱色摇床上低速振荡10 min,酶联免疫检测仪在波长490 nm处测量各孔的吸光度值，取平均值，共测量8次。无抗生素组和抗生素组均测量4组。

1.3.4 BMSCs活力测定 取原代到第7代传代细胞。0.25%胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，浓度1×105/ml，以0.4%台盼蓝作染色剂，用细胞计数板计数，共计数5次，取其平均值，计算细胞活力：活细胞率(%)=活细胞/(活细胞+死细胞)×100%[6]。

1.3.5 BMSCs细胞表面标记物鉴定 细胞生长接近90%左右融合时，取第五代生长良好的细胞，0.25%胰蛋白酶消化后，PBS冲洗两遍，并制备成5×105/ml浓度的单细胞悬液，取0.1 ml细胞悬液置于不同离心管中，各离心管分别加入CD 90、CD 73、CD 105、CD 45/34/11b/19/HLA-DR的一抗，室温反应30 min后，PBS洗涤两遍后与FITC标记的二抗避光反应30 min，将洗涤后的细胞重悬于PBS中，作为流式细胞分析用。

2 结 果

2.1 细胞形态学观察 原代细胞接种3 d后首次半量换液，可见少量多角形单个核细胞贴壁生长。5 d首次全量换液，PBS溶液轻轻洗涤2次，去除大量杂质后可见MSCs呈集落样生长，细胞逐渐变为长梭形，胞核呈圆形或椭圆形，胞浆可见颗粒样物质。7～8 d细胞生长迅速，小集落融合成大集落。10～12 d细胞达95%以上融合，细胞形态为长梭形，紧密排列，呈漩涡状。细胞再行传代培养后，形态更加均一，增殖速度明显加快，5 d即能达到80%～90%融合。第1代细胞A瓶无抗生素组培养5 d后细胞生长情况(图1)；B瓶有抗生素组培养5 d后细胞生长情况(图2)。两者比较发现，A瓶有更多细胞贴壁生长，增殖也更迅速。

2.2 BMSCs生长曲线测定 MTT法测定第3代细胞生长曲线，细胞消化种板后，在24 h内两组细胞生长增殖均不明显，处于潜伏期；之后均进入对数生长期快速生长，无抗生素组细胞进入对数生长期的时间早于抗生素组，峰值也高于抗生素组；两组均在6～7 d进入平台期(图3、4)。

2.3 BMSCs活力测定 两组细胞原代至第3代细胞存活率基本相同，从第4代开始细胞活力下降，第6代开始下降明显，第7代最低。从第1代开始，无抗生素组细胞的存活率高于抗生素组(图5、6)。

2.4 流式细胞鉴定结果分析 经鉴定，兔BMSCs表面抗原CD90表达率100%，CD105表达率99.22%，CD73表达率99.99%，呈阳性；CD45/34/11b/19/HLA-DR(0.50%)，呈阴性，基本不表达，由此证明本研究培养的细胞是约99%为MSCs(图7)。

3 讨 论

相比软骨细胞，BMSCs更容易获得，对捐献者的伤害比较小，容易增殖，BMSCs已成为组织工程学研究的热点。BMSCs具有强大的多能性和分化能力。获得BMSCs的方法有很多，目前比较常用的有密度梯度离心法、直接贴壁法、流式细胞仪分离法及免疫磁珠分离法[7]。密度梯度离心法主要根据骨髓中各细胞成分的比重不同，分离提取单个核细胞进行贴壁培养。此法获得的原代BMSCs纯度高，但贴壁细胞量少、活性低，细胞融合时间长。流式细胞仪分离法是根据BMSCs体积小，相对缺少颗粒的特性进行分选[8]。免疫磁珠分离法是根据BMSCs表达的某些细胞表面标志物进行收集或根据其表面负表达的抗原进行负筛选[9]。这两种方法获得的BMSCs纯度高，但BMSCs数量少，活性低，且成本高，技术难，所以应用不多。

本研究采用直接贴壁法分离BMSCs。此法根据BMSCs贴壁生长，造血系细胞悬浮生长的特性，采用半保留换液，即原代培养3 d后轻轻吸取上层培养基，再加入相同量的新鲜培养基，这样即去除了杂质和不贴壁细胞，又保证了细胞生长所需要的营养。研究发现，采用直接贴壁法分离、纯化MSCs，经过2次传代培养后，其细胞纯度达95%～98%。

从BMSCs的生长曲线可以看出，BMSCs体外培养需经过3个生长时期，即潜伏期，对数生长期和平台期。不同代次的细胞活力不同，原代到第3代，传代次数越多，细胞增殖能力越强，从第3代开始，随着传代次数增多，细胞增殖能力逐渐减弱，这可能与细胞的老化有关。本次试验所采用的培养方法和其他传统方法相比，有一个改进的地方：在原代培养时在培养基中添加双抗，这能抑制细菌生长，防止污染，但同时也抑制了间充质干细胞的活力，影响其生长和增殖。从第1代开始不再添加双抗，这利于细胞的生长、增殖。实验证明，这种培养方法不但前期降低了污染的发生率，而且提高了细胞的生长、增殖速率。

BMSCs无特异性标志物分子，因此，无直接的鉴别BMSCs的方法。通过对培养中的分化型的BMSCs进行实验室鉴定，然后推知是否是BMSCs[10]。在MSCs的表面分子中，CD34必须呈阴性表达[11]。因此，当前在行流式细胞仪分离法时，一般首先排除BMSCs不表达的造血细胞表面抗原，如造血前体细胞标志抗原CD34，白细胞标志抗原CD45等；再检测BMSCs表达阳性的细胞表面标志物，如CD13、CD29、CD73、CD90、CD105等[12]由于本研究体外培养的BMSCs高效表达CD90、CD105、CD73，不表达造血系细胞的CD34、CD45等分子，因此，多采用排除法鉴定BMSCs。本研究对第五代细胞做流式细胞鉴定结果显示，CD90、CD105、CD73为阳性， CD34、CD45为阴性，证明本研究培养的细胞是BMSCs。

综上所述，本研究采用改良的直接贴壁法获得了大量、纯化、稳定的BMSCs，建立了一套简单易行，成本低廉的BMSCs体外分离、培养的方法，为进一步的研究打下了基础。

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(2013-11-11收稿 2014-02-27修回)

(责任编辑 岳建华)

Invitroisolationandcultureofrabbitbonemarrowmesenchymalstemcellsusingdirectlyadherentmethod

DING Chen1, ZHANG Zhongwen2, and NIE Qinghu2. 1. Graduate School Xuzhou Medical College, Xuzhou 221004, China; 2. 4th Orthopedics Department, General Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces, Beijing 100039, China

ObjectiveTo observe and identify the biological characteristics of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells, and establish a set of simple , viable culture methods.MethodsRabbit bone marrow mesenchymal stem cells were extracted through adherent method directly, and use the inverted microscope to observe period morphology. The value-added level of the cells was assayed by MTT and the growth curve was drawn.The third passage of bone marrow mesenchymal stem cell phenotypes were measured by flow cytometry.ResultsUnder the microscope,cells were small colony growth with shape of polygons when cells were cultured at the 5th day.Small colony confluent colony at 7-8 th day.The cells could be passaged at about 10th day.The second passage of cells showed long fusiform and fibroblast-like growth,that means marrow mesenchymal stem.The cell growth curve was S-shaped.Flow cytometry results showed that the cells expressed CD 73，CD 90，CD 105, and did not express CD 34,CD 45.ConclusionsThe directly adherent method can get apundant, purified, and stable mesenchymal stem cells .

directly adherent method;rabbits;bone mesenchymal stem cells

丁 晨，在读研究生，E-mail: dcyang622@163.com

1. 221004，徐州医学院；2. 100039北京，武警总医院骨四科

张仲文，E-mail: zzwen3@gmail.com

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