中晚期肝癌肝动脉栓塞化疗是否联合过继T细胞免疫疗法的疗效比较

曹 亮，李 伟，盛 俊，彭 勋，彭 勇，郭聪珊，田 茹

中晚期肝癌肝动脉栓塞化疗是否联合过继T细胞免疫疗法的疗效比较

曹 亮1，李 伟1，盛 俊1，彭 勋1，彭 勇2，郭聪珊2，田 茹2

目的观察肝动脉栓塞化疗(transcatheter arterial chemoembolization，TACE)联合过继T细胞免疫疗法对中晚期肝癌的近期疗效，以及对外周血T淋巴细胞亚群及Treg细胞计数的影响。方法回顾分析114例中晚期原发性肝癌患者实行TACE联合过继T细胞疗法(研究组)或单一TACE治疗(对照组)的资料。研究组(56例)全部经过TACE术且术后第2天接受过继T细胞回输；对照组(58例)仅接受TACE治疗。治疗为每4周一次，最多不超过3次，观察疗程为2年。观察无进展生存期(progress free survival, PFS)和总生存期(overall survival, OS)，以及治疗前后相同时间点测定T淋巴细胞亚群、Treg细胞以及AFP计数变化。结果研究组与对照组的近期疗效及AFP下降率比较，无统计学差异。研究组治疗后6个月、1年、2年的无进展生存率分别是71.4%、23.2%、5.4%；对照组分别是65.5%、31.0%、3.4%。两组中位疾病进展时间分别是8个月(95%CI，8-11个月)和5个月(95%CI，6-9个月)。研究组治疗后6个月、1年、2年的总生存率分别是89.2%、71.4%、60.7%，对照组分别是70.6%、41.4%、17.2%。两组中位生存期分别是18个月(95% CI，16-20个月)和11个月(95% CI，9-13个月)。研究组CD4+细胞比率由治疗前(51.27±4.85)%升至(54.51±5.03)%，CD8+以及Treg细胞计数分别由(40.87±3.26)%和(6.36±0.98)%下降至(37.24±3.56)%和(3.89±0.31)%，CD4+/CD8+比值增大(P<0.05)；对照组治疗后与治疗前相比无统计学差异。结论中晚期肝癌患者TACE术后联合过继T细胞疗法可提高无进展生存期和总生存期，并能提高免疫能力，增强机体的抗肿瘤效应，有可能降低中晚期肝癌患者的复发率和转移率。

原发性肝癌；肝动脉化疗栓塞；过继T细胞疗法；无进展生存期；总生存期；T淋巴细胞亚群；Treg细胞

原发性肝癌已成为世界范围内的第五大肿瘤[1]，是我国肿瘤导致死亡的第二大原因。早期原发性肝癌的治疗方法首选手术治疗和肝移植，据报道，只有20%的原发性肝癌患者从中受益[2]。由于大部分肝癌患者就诊时多属于中晚期，已丧失了手术的最佳时机，对这类患者的治疗国内外已经把肝动脉化疗栓塞术(transcatheter arterial chemoembolization，TACE)确定为最佳非手术治疗手段之一。然而，应用TACE仍然有不能消灭肿瘤细胞和难以控制肿瘤复发的局限性[2-6]。

自体初始型T细胞(Naïve T细胞)是过继细胞疗法的主要细胞来源，在体外由初始型T细胞制备效应性抗原特异性T细胞的程序与初始型T细胞转化成效应性T细胞的体内生理过程基本一致。此疗法是利用每个原发性肝癌患者自身的DC细胞诱导出具有其自身肝癌细胞抗原特异性T细胞，使肝癌患者个体化治疗成为可能[7]，其免疫优势是对肿瘤细胞的杀伤作用有持久性和特异性。Diego等[8]研究表明，联合过继T细胞免疫疗法治疗原发性肝癌小鼠模型，12个月存活率可达到100.0%，肿瘤消失率可达到100.0%，并且肝癌无复发。

本研究通过回顾114例中晚期原发性肝癌患者，主要评估TACE联合过继T细胞疗法对中晚期肝癌患者的短期疗效、免疫功能、无进展生存期(progression-free survival，PFS)和总生存期(overall survival，OS) 的影响。

1 资料与方法

1.1 资料 选择我院从2007-01至2012-12收治的年龄超过18岁，经病理或临床证实且病例资料完整的不能手术切除的原发性肝癌患者114例，且实行TACE联合过继T细胞疗法或单一TACE治疗。患者一般状况良好，ECOG评分0～2分，其中103例(90.4%)HBsAg阳性，所有患者外周血白细胞计数均>3.0×1012，血小板计数>100×109，肿块直径为4～10 cm，无淋巴结转移，无远处转移。所有患者按照2002年国际抗癌联盟(UICC)分期为Ⅱ期或Ⅲa或Ⅲb期；Child-Pugh A级103例(90.3%)，B级11例(9.6%)。依据患者意愿，56例患者接受TACE联合过继T细胞疗法，作为研究组。另58例患者仅接受TACE治疗，作为对照组。全部患者治疗前均签署知情同意书。两组患者治疗前60 d均未接受任何放化疗或影响免疫功能的药物。研究组男50例，女6例，平均(52.0±4.1)岁；对照组男50例，女8例，平均(51.0±3.4)岁。两组病例临床分期及肿瘤分级等比较，差异无统计学意义(表1)。

1.2 仪器和主要试剂 流式细胞仪(美国BD公司)，二氧化碳培养箱(珠海市再鑫仪器有限公司)，倒置显微镜(日本Nikon公司)，低速离心机(北京医用离心机厂)。流式细胞抗体：CD3单克隆抗体、CD4单克隆抗体、CD8单克隆抗体、淋巴细胞分离液、白细胞因子，均为美国ABCAM公司产品。培养基及培养皿均为Corning公司产品。

1.3 方法

1.3.1 TACE 采用Seldinger穿刺插管技术，局部麻醉，经皮右股动脉穿刺，导管选择至肿瘤供血动脉行DSA造影，根据肿瘤血供情况进行栓塞。TACE药物选择吡柔比星30～50 mg，喜树碱5 mg，碘化油10～20 ml，碘海醇5～10 ml。每4周治疗1次，最多不超过3次。

1.3.2 过继T细胞制备 抽取40 ml患者外周富集血，经淋巴细胞分离液分离出单个核细胞，用含10%人AB型血清的1640培养液调整细胞浓度为(1～3)×106/ml，放入二氧化碳培养箱进行培养。第1天加入人重组白介素(IL-1α)100 U/ml、人重组干扰素(IFN-γ)100 U/ml，培养第2天加入人重组IL-2 500 U/ml，第4天、第5天分别加肿瘤坏死因子(TNF)3000 U/ml。每3 d更换新鲜培养液，培养7 d后，收获细胞，50%回输给患者，同日抽取患者40 ml外周血，加入剩余50%细胞中再次培养7 d，方法同上。

1.3.3 过继T细胞回输 治疗组在TACE术当天回输第2次培养的过继T细胞给患者，细胞数在(0.01～1)×108，整个回输过程保持在30 min内完成。30 d为一疗程，1年不超过4个疗程。

1.4 疗效评价 检测研究组与对照组治疗前1周及治疗后2周患者外周血AFP、T淋巴细胞(CD4+、CD8+)和CD4+、CD25+Treg细胞等免疫指标水平的变化。疗效评价依据CT或MRI 检查，确定肿瘤缩小的程度，根据WHO实体肿瘤疗效评价标准疗效，分为完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、疾病稳定(SD)、疾病进展(PD)，客观有效率为CR+PR。计算无进展生存率和总生存率。

2 结 果

2.1 近期疗效 治疗后，研究组56例中，CR、PR、SD和PD分别为 8、40、5和3例；对照组58例中，分别为4、30、18和6例。研究组有效率85.7%，高于对照组有效率58.6%，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 T淋巴细胞亚群及Treg细胞的变化 研究组治疗后与治疗前相比，CD4+T细胞增多，CD8+T细胞减少，CD4+/CD8+比值增大，Treg细胞减少(P<0.05)；而对照组患者治疗后与治疗前相比无统计学差异(表2)。

注：与治疗前比较，①P<0.05；与对照组比较，②P<0.05

2.3 随访 平均随访时间为24个月(6～33个月)。114例均死亡，死亡原因为肿瘤复发、远处转移、肝衰竭、上消化道大出血。研究组6个月、1年和2年无进展生存率和总生存率与对照组进行对比，研究组的无进展生存率和总生存率均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01，表3)。

注：与对照组比较，①P<0.01

2.4 不良反应 研究组(56例患者)治疗后1周内出现疼痛20例次(35.7%)，发热12例次(21.4%)，白细胞计数减少3例次(5.3%)，肝功能损害0例次(0%)，不良反应共计35例次(62.5%)；对照组(58例患者)中出现疼痛35例次(60.3%)，发热20例次(34.5%)，白细胞计数减少6例次(10.3%)，肝功能损害2例次(3.4%)，共计63例次(108.6%)；研究组的不良反应发生率低于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。上述不良反应经过对症处理后均缓解或消失。

3 讨 论

原发性肝癌在治疗上，通常采取手术、放疗、化疗、介入治疗、直线加速器、伽马刀、射频消融术、中医等疗法，但晚期患者因癌细胞扩散而治愈率低。半个世纪以来，世界各国肝癌的发病率和病死率都呈现增高的趋势，到目前为止，肝癌的治疗效果仍不满意。虽然手术和肝移植仍是肝癌的首选治疗方法，但由于大部分患者发现时已是晚期，而且肝源缺乏也限制了肝移植的实施。

目前TACE最常用于肝癌的治疗，包括肝动脉插管化疗栓塞和肝动脉插管化疗灌注。TACE作为不可切除晚期肝癌的的首选治疗方法，在世界范围内已得到了广泛运用，并取得了较好疗效。由于大部分原发性肝癌的血供来源于肝动脉，所以TACE可使化疗药物在肿瘤组织首次浓度达到100%。然后，部分药物经过靶器官静脉回流进入体循环，这时相当于药物从静脉注入，从而导致癌细胞的凋亡[9]。研究发现，TACE法也有缺陷，TACE的缺点就在于不能完全杀死肝癌细胞。肝癌患者均具有免疫缺陷，这与肝癌不易控制甚至易复发也有很大关系。

本研究应用TACE疗法联合过继T细胞免疫疗法，即应用栓塞、化疗与免疫联合疗法，对中晚期肝癌的近期疗效，以及外周血T淋巴细胞亚群和Treg细胞计数进行了观察和分析。结果显示，TACE后联合过继T细胞免疫疗法与单纯TACE治疗法比较，中晚期肝癌的近期疗效、无进展生存期以及总生存期均有提高(P<0.05)，表明TACE后联合过继T细胞免疫疗法对于中晚期肝癌的治疗效果优于单纯TACE治疗法。AFP是原发性肝癌的高特异性和高灵敏度的肿瘤标志物，肝癌患者的AFP常常明显升高。但是，在本研究中两组AFP下降率相比较无统计学差异，可能原因是大约80%成人的肝癌血清AFP才出现升高，而且肿瘤与肿瘤标志物之间只是一种相关性的关系，并不是一一对应的关系，也就是说，肝癌状况的变化不一定引起AFP的明显改变。

根据《流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群指南》，CD4+T细胞减少或CD8+T细胞增多可见于恶性肿瘤。CD4+/CD8+比值是免疫调节的一项重要指标，正常值1.4～2.0，若其比值<1.4可见于恶性肿瘤。在本研究中，研究组患者治疗后与治疗前相比，CD4+T细胞增多、CD8+T细胞减少、CD4+/CD8+比值增大且>1.4、Treg细胞减少(P<0.05)；而对照组患者治疗后与治疗前相比无统计学差异。结果表明，研究组的疗效优于对照组，TACE联合过继T细胞免疫疗法具有较好的治疗作用。

有研究发现，Treg浸润多和CD8+细胞毒性T淋巴细胞的高表达是肝癌患者预后差的反映，与肝癌疾病进展有关[10，11]。如果应用小剂量的化疗药物清除肿瘤微环境中的抑制性细胞(主要是Treg细胞)，可以增加抗肝癌患者的疗效[12]。由此可以解释TACE后联合过继T细胞疗法可以提高患者的近期疗效、无进展生存期和总生存期，本课题结果也证实了这个学术观点。另外，从临床观察来看，TACE术后采用过继免疫T细胞疗法的肝癌患者耐受性好，不良反应小。

从免疫学方面看，在固有的NK与NKT细胞有一定的杀伤癌细胞的作用，但是彻底清除癌细胞，需依靠抗原特异性T细胞介导的适应性细胞免疫反应[13，14]，未来良好而有效的过继细胞疗法的免疫细胞必须来自T细胞[15]。TACE能够清除局部肿瘤本身，过继T细胞免疫疗法又能够清除机体残留的微小病灶。这两种方法结合，既针对了局部肿瘤的治疗又改善了抑制性免疫微环境，可达到个体化全身治疗的目的。

总之，本研究表明，TACE联合过继T细胞疗法，在短期内可以提高机体抗肿瘤的免疫能力，从而提高了患者的无进展生存期和总生存期。

[1] Parkin D M, Bray F, Ferlay J,etal. Estimating the world cancer burden: Globocan 2000 [J]. Cancer, 2001, 94(2): 153-156.

[2] Achenbach T, Seifert J K, Pitton M B,etal. Chemoembolization for primary liver cancer [J]. Eur J Surg Oncol, 2002, 28(1): 37-41.

[3] Mizoe A, Yamaguchi J, Azuma T,etal. Transcatheter arterial embolization for advanced hepatocellular carcinoma resulting in a curative resection: report of two cases [J]. Hepatogastroenterology, 2000, 47(36): 1706-1710.

[4] Llovet J M, Real M I, Montana X,etal. Arterial embolisation or chemoembolisation versus symptomatic treatment in patients with unresectable hepatocellular carcinoma: a randomised controlled trial [J]. Lancet, 2002, 359(9319): 1734-1739.

[5] Li L, Wu P H, Li J Q,etal. Segmental transcatheter arterial embolization for primary hepatocellular carcinoma [J]. World J Gastroenterol, 1998, 4(6): 511-512.

[6] Chen M S, Li J Q, Zhang Y Q,etal. High-dose iodized oil transcatheter arterial chemoembolization for patients with large hepatocellular carcinoma [J]. World J Gastroenterol, 2002, 8(1): 74-78.

[7] Matar P, Alaniz L, Rozados V,etal. Immunotherapy for liver tumors: present status and future prospects [J]. J Biomed Sci, 2009, 16(30): 1-18.

[8] Avella D M, Li G, Schell T D,etal. Regression of established hepatocellular carcinoma is induced by chemoimmunotherapy in an orthotopic murine model [J]. Hepatology, 2012, 5(1): 141-152.

[9] Lo C M, Ngan H, Tso W K, Liu C L,etal. Randomized controlled trial of transarterial lipiodol chemoembolization for unresectable hepatocellular carcinoma [J]. Hepatology, 2002, 35(5): 1164-1171.

[10] Wang F M, Jing X, Li G,etal. Foxp3+ regulatory T cells are associated with the natural history of chronic hepatitis B and poor prognosis of hepatocellular carcinoma [J]. Liver Int, 2012, 32(4): 644-655.

[11] Pedroza-Gonzalez A, Verhoef C, Ijzermans J,etal. Activated Tumor-Infiltrating CD41 Regulatory T Cells Restrain Antitumor Immunity in Patients with Primary or Metastatic Liver Cancer [J]. Hepatology, 2013, 57(1): 183-194.

[12] Imai H, Saio M, Nonaka K,etal. Deletion of CD4+CD25+regulatory T cells enhance interleukin-2-induced antitumor immunity in a mouse model of colon adenocarcinoma [J].Cancer Sci, 2007, 98(3): 416-423.

[13] Correale P, Botta C, Cusi M Getal. Cetuximab ± chemothrapy enhances dendritic dcell-mediated phagocytosis of colon cancer cells and ignites a highly efficient colon cancer antigen-specific cytotoxic T-cell response in vitro [J]. Int J Cancer, 2012, 130(7): 1577-1589.

[14] Wolpoe M E, Lutz E R, Ercolini A M,etal. HER-2/neu-secific monoclonal antibodies collaborate with HER-2/neu-targeted granulocyte macrophage colony-stimulating factor secreting whole cell vaccination to augment CD8+T cell effector function and tumor-free survival in Her-2/neutransgenic mice [J]. J Immunol, 2003, 171(4): 2161-2169.

[15] Dudley M E, Wunderlich J R, Robbins P F.etal. Cancer regression and autoimmunity in patients after clonal repopulation with antitumor lymphocytes [J]. Science, 2002, 298 (5594): 850-854.

(2013-11-11收稿 2014-02-14修回)

(责任编辑 武建虎)

WhetherthesystemictranscatheterarterialchemoembolizationoughttocombinewithadoptiveTlymphocytesfortheadvanced-stagehepatocellularcarcinoma:acomparativestudy

CAO Liang1, LI Wei1, SHENG Jun1, PENG Xun1, PENG Yong2, GUO Congshan2, and TIAN Ru2. 1. Department of Medical Oncology, Qinhuangdao No.3 Hospital, Qinhuangdao 066000, China; 2. Department of Biomedical Engineering, Yanshan University, Qinhuangdao 066004, China

ObjectiveTo study the different affects of TACE alone and TACE combined with adoptive T lymphocytes on the peripheral T lymphocyte subsets and Treg cells for advanced hepatocellular carcinoma(HCC).Methods114 patients with advanced stage HCC were recruited, 56 patients were treated with TACE followed by adoptive T lymphocytes treatment，and 58 patients were treated with TACE only as a control group. Each patient was treated once a month, successive 3 times were a course of treatment. The duration of the observation was 2 years. The progress free survival(PFS) and overall survival(OS), serum levels of AFP, T lymphocyte sunsets and Treg cells in peripheral blood of advanced HCC patients were found out before and after the treatments.ResultsThe short-term responses in the 2 groups were similar. There was also no significant difference in the reduction rates of AFP between these two groups. The 6 months, 1 year, and 2 years PFS rates were 71.4%, 23.2%, 5.4% in combination group, and 65.5%, 31.0%, 3.4% in control group. The median TTP (time to progression)was 8 months (95% confidence interval CI，8-11 months) for combination group and 5 months(95% confidence interval CI，6- 9 months) for control group. The proportion of 6 months, 1 year, and 2 years OS were 89.2%, 71.4% and 60.7% in combination group, while in control group they were 70.6%, 41.4%, 17.2%(P<0.05) , respectively. The median survival time was 18 months(95% CI，16-20 months)in combination group and 11 months(95% CI，9-13 months)in control group. In the study group, the percentage of CD4+increased from(51.27±4.85)% to(54.51±5.03)% (P<0.05), CD8+and Treg cells decreased from (40.87±3.26)%，(6.36±0.98)% to (37.24±3.56)%,(3.89±0.31)% (P<0.05), respectively. The rates of CD4+/CD8+increased greatly(P<0.05). There was no significant difference compared between before and after treatment in the control group.ConclusionsAdjuvant immunotherapy with adoptive T lymphocytes may prolong the PFS and OS in advanced HCC patients, and there is a statistically significant difference. It can improve immunological status as well as the efficacy of TACE in these patients. It may also play an important role in reducing the recurrence and metastases in HCC patients.

hepatocellular carcinoma; transcatheter arterial chemoembolization; adoptive T lymphocytes; progression free survival; overall survival; T lymphocyte subset; Treg cells

秦皇岛市2012年科学技术研究与发展计划项目(编号：2012023A217)

曹 亮，硕士，主治医师，E-mail：drcaol@hotmail.co.uk

1. 066000，秦皇岛市第三医院肿瘤科; 2. 066004秦皇岛, 燕山大学生物医学工程系

彭 勇，E-mail：PY81@sina.com

R735.7