Ⅰ型IFN 体外增强人γδT 细胞对骨肉瘤的杀伤作用①

李朝旭 王锐英 唐际存 (桂林医学院附属医院骨二科，桂林 541004)

免疫治疗是恶性肿瘤的有效治疗方法之一，其中过继免疫细胞治疗是目前研究的热点。γδT 细胞与αβ T 细胞不同，对肿瘤细胞的识别、杀伤显现出MHC 非限制性，因此γδT 细胞作为种子细胞的过继免疫治疗越来越受到人们的关注［1］。尽管越来越多的研究表明γδT 细胞对多数肿瘤具有杀伤作用，但是由于肿瘤存在多种的抑制性因素，影响了γδT细胞进一步应用，因此，如何提高γδT 细胞肿瘤免疫治疗效果成为目前急需解决的问题［2］。

我们先前研究显示，Ⅱ型干扰素-γ(Interferon，IFN-γ)通过Fas/FasL 途径增强人来源的γδT 细胞对骨肉瘤(Osteosarcoma，OS)的杀伤作用［3，4］。但是作为目前已广泛临床应用的Ⅰ型IFN，能否增强人γδT 细胞识别和杀伤OS 的作用未见报道。本研究观察Ⅰ型IFN 体外刺激人γδT 细胞的抗OS 细胞的效应，拟为OS 患者的免疫辅助治疗提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料 人骨肉瘤细胞系HOS 购自中国科学院上海细胞所。唑来膦酸(Zoledronate，Zol)为瑞士诺华制药公司产品，人重组白介素2(Interleukin-2，IL-2)，Ⅰ型IFN:IFN-α、IFN-β 购自上海普欣生物有限公司。淋巴细胞分离液购自加拿大Cedarlane 公司，CytoTox 96®非放射性细胞毒性试剂盒为Promega 公司产品，人IFN-γ ELISA 试剂盒购自美国eBioscience 公司。鼠抗人TCR-γδ-PE 抗体、CD3-FITC抗体为美国eBioscience 公司产品。CytomicsTMFC500 型流式细胞仪为美国Beckman-Coulter 公司。胎牛血清、RPMI1640 干粉为Gbico 公司产品。

1.2 方法

1.2.1 γδT 细胞制备和鉴定 取人静脉抗凝血5 ml，磷酸缓冲液(Phosphate buffer solution，PBS)1∶1稀释，用淋巴细胞分离液分离获取人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)，取24 孔培养板，每孔加入1 ml 细胞悬液，培养液为含100 ml/L 的胎牛血清的RPMI1640 培养液，细胞密度为1 ×106～2 ×106ml;培养第1 天加入Zol 1 μmol/L 和人rIL-2 400 U/ml;以后每3 d 更换一半含人rIL-2 400 U/ml 或Ⅰ型IFN:IFN-α 和IFN-β 400 U/ml 的新鲜培养液，培养14 d 收获γδT 细胞，加入抗人TCR-γδ-PE mAb 2 μl 和抗人CD3-FITC mAb 1 μl 后4℃避光孵育30 min，流式细胞技术检测γδT 细胞的纯度，计算扩增倍数。公式:扩增倍数=(扩增后总细胞数×扩增后γδT 细胞的纯度)/(扩增前总细胞数×扩增前γδT 细胞的纯度)［5］。

1.2.2 细胞毒性试验 以人骨肉瘤细胞系HOS 为靶细胞，设置不同效靶细胞比，根据乳酸脱氢酶释放法检测的操作说明，检测并计算γδT 细胞的细胞毒性［5］。

1.2.3 γδT 细胞分泌的IFN-γ 水平的检测 按照以前我们研究方案［6］，根据人IFN-γ ELISA 试剂盒的操作说明，检测并绘制标准曲线，计算IFN-γ浓度。

2 结果

2.1 γδT 细胞的体外扩增 4 例健康人志愿者和10 例骨肉瘤患者(其中4 例原发性骨肉瘤，3 例复发性骨肉瘤和3 例转移性骨肉瘤)参与本研究、其中健康人志愿者和骨肉瘤患者γδT 细胞的纯度在扩增前依次分别为(2.4±1.7)%和(2.2±0.9)%，两者无统计学差异;经过Zol 体外刺激诱导2 周后，γδT 细胞的纯度达到(93.2±2.0)%，其中健康人志愿者γδT 细胞的纯度为(94.6±1.6)%，骨肉瘤患者为(91.8±0.6)%，无统计学差异;扩增倍数为(290.4±73.1)倍，其中健康人志愿者γδT 细胞的扩增(398.4±73.1)倍，骨肉瘤患者为(162.4±83.2)倍，两者有统计学差异(P ＜0.01)。

2.2 Ⅰ型IFN 对γδT 细胞的增殖影响 分别使用IFN-α、IFN-β 联合Zol 体外刺激诱导14 d 后，γδT细胞 的 纯 度 分 别 为(91.9±1.0)% 和(90.9±1.3)%，其中健康人志愿者γδT 细胞的纯度分别为(93.6±1.2)%和(94.1±2.1)%，骨肉瘤患者分别为(90.2±0.8)%和(88.9±1.7)%，与Zol 组相比均无统计学差异(P ＞0.05);扩增倍数分别为(272.4±83.2)倍和(262.4±77.6)倍，其中健康人志愿者γδT 细胞的扩增分别达到(432.4±80.2)倍和(392.4±97.3)倍，骨肉瘤患者为分别达到(172.4±83.2)倍和(162.4±70.1)倍，骨肉瘤患者与健康人的γδT 细胞的扩增有统计学差异(P ＜0.01);但与Zol 组相比，IFN-α 组和IFN-β 组骨肉瘤患者γδT 细胞的扩增无统计学差异(P ＞0.05)。

2.3 Ⅰ型IFN 对健康人γδT 细胞杀伤活性的影响 图1 为健康人γδT 细胞在1.5∶1、3∶1、6∶1和12∶1的效靶比下，对HOS 细胞的杀伤作用。在较低效靶比情况下，健康人γδT 细胞对HOS 细胞的杀伤作用较弱，但是分别使用IFN-α、IFN-β 预处理γδT 细胞72 h 后，健康人γδT 细胞对HOS 细胞的杀伤作用显著增强，结果具有显著统计学差异(P ＜0.01)。

2.4 Ⅰ型IFN 对骨肉瘤患者γδT 细胞杀伤活性的影响 图2 显示，不同类型骨肉瘤患者PBMCs 来源的γδT 细胞在效靶比为3∶1时，对HOS 细胞杀伤率较弱。分别使用IFN-α、IFN-β 预处理γδT 细胞72 h后，骨肉瘤患者PBMCs 来源的γδT 细胞对骨肉瘤细胞杀伤活性显著增加(P ＜0.05)。

2.5 Ⅰ型IFN 对γδT 细胞分泌IFN-γ 的影响 在效靶比为3∶1时，与HOS 细胞共培养6、24 和48 h，健康人PBMCs 来源的γδT 细胞分泌IFN-γ 较少，分别使用IFN-α、IFN-β 预处理γδT 细胞72 h 后，HOS细胞刺激γδT 细胞分泌IFN-γ 显著增加(图3，P ＜0.05)。

图1 Ⅰ型IFN 对健康人γδT 细胞杀伤骨肉瘤细胞的影响Fig.1 Effect of type ⅠIFN on cytotoxic activity of γδT cells from healthy donors

图2 Ⅰ型IFN 对骨肉瘤患者γδT 细胞杀伤骨肉瘤细胞的影响Fig.2 Effect of type ⅠIFN on cytotoxic activity of γδT cells from osteosarcoma patients

图3 Ⅰ型IFN 对γδT 细胞分泌IFN-γ 的影响Fig.3 Effect of type Ⅰ IFN on IFN-γ released by γδT cells

3 讨论

目前有关γδT 细胞免疫治疗骨肉瘤的研究逐渐受到关注。我们研究表明Zol 体外刺激骨肉瘤患者、健康人PBMC，能高度选择性扩增γδT 细胞［5］。另外，这种方法扩增的γδT 细胞在体内外均具有抗OS 作用［6］。但是由于肿瘤存在多种的抑制性因素，如肿瘤细胞分泌抑制性细胞因子、肿瘤微环境中的抑制性细胞等，影响了γδT 细胞进一步应用。为提高γδT 细胞的杀伤作用，我们分别使用IFN-γ、Zol预处理骨肉瘤细胞，发现IFN-γ、Zol 能促进γδT 细胞对骨肉瘤的杀伤作用［3，4，7］。但是，体内使用IFNγ、Zol 具有较大的毒副作用以及临床效果的不确定性，限制了进一步临床应用。因此，如何减少药物毒副作用、提高体外培养的γδT 细胞的细胞杀伤作用成为目前研究的热点［1］。

IFN 分IFNⅠ、IFNⅡ和IFN Ⅲ三型，其中IFNⅠ型主要包括IFN-α 和IFN-β。研究显示，Ⅰ型IFN可通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，抑制病毒的复制;同时还可增强NK 细胞活性，促进B 细胞的增生，增强体液免疫反应。IFN-α 也能上调细胞表面MHCⅠ类分子的达，增强CD8+细胞毒性T 细胞反应。由于具有强大的抗病毒和免疫调节作用，Ⅰ型IFN 已广泛应用于临床。本研究使用IFN-α 和IFN-β，观察其对γδT 细胞的体外扩增和杀伤作用的影响。研究显示，Ⅰ型IFN 对γδT 细胞的体外增殖尽管没有影响，但是分别使用IFN-α、IFNβ 预处理γδT 细胞后，健康人γδT 细胞对HOS 细胞的杀伤作用显著增强;尤其重要的是，这种作用同样适用于不同类型骨肉瘤患者的γδT 细胞，为骨肉瘤患者应用自体γδT 细胞免疫治疗提供了技术支持。进一步研究发现，分别使用IFN-α、IFN-β 预处理γδT 细胞72 h 后，γδT 细胞分泌IFN-γ 能力显著增加，结果与Watanabe 等［8］研究结果一致。

本研究不足之处是:尽管本研究中Ⅰ型IFN 能增强γδT 细胞的体外抗OS 作用，但是其在体内试验中的作用如何，还需进一步研究确定。此外，Ⅰ型IFN 能促进γδT 细胞分泌IFN-γ，但其具体机制目前尚不清楚，因此，Ⅰ型IFN 促进γδT 细胞分泌IFN-γ机制的阐明，将为Ⅰ型IFN 联合γδT 细胞治疗骨肉瘤带来新的机遇。

综上所述，使用Ⅰ型IFN 体外扩增γδT 细胞，不仅能增强γδT 细胞具有抗OS 作用，还克服了Ⅰ型IFN 的毒副作用，为骨肉瘤的治疗提供了新的途径。

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［6］李朝旭，唐际存，孙凌凌，等.唑来膦酸对骨肉瘤患者PBMCs来源γδT 细胞抗骨肉瘤作用的影响［J］.细胞与分子免疫学杂志，2013，29(1):6-9.

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