Ki-67、P53、LAT1 在食管癌及癌前病变组织中的表达及其临床意义①

杜 博 魏海峰 赵雪梅 倪志强 谭 岩 方艳秋

(吉林省人民医院肿瘤生物治疗中心，长春 130021)

食管癌是常见的消化系统肿瘤之一，其发生是一个多因素、多阶段的，涉及多种基因异常表达的复杂生物学过程。分子生物学研究揭示:细胞增殖活性异常、癌基因和/或抑癌基因的突变、过度表达以及细胞凋亡过程的抑制，在食管癌发病机制中均起重要作用［1］。此外，肿瘤细胞的快速生长有赖于高程度的能量代谢和大量的蛋白合成，而蛋白合成则需要充足的氨基酸供给。大型氨基酸转运载体1(Large-type amino acid transporter 1，LAT1)是一种不依赖Na+的大型、中性氨基酸转运载体［2］。近年来有关资料显示LAT1 高表达与人类多种类型肿瘤的发生和发展密切相关［3，4］，但在食管癌中的表达国内外尚未见相关报道。本研究采用免疫组织化学技术检测食管癌及癌前病变组织中增殖细胞核抗原(Ki-67)、肿瘤抑制基因P53(P53)及LAT1 基因的蛋白表达产物，分析它们与食管癌病理分级的相关性，以探讨食管癌的发生机制，为食管癌的早期诊断和预后评估提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 临床病理标本 选取吉林省人民医院2011 年至2014 年食管鳞癌手术切除标本及胃镜活检组织，所有病例均未接受术前放化疗，且均经病理学确诊。标本分为正常组20 例，癌前病变组68 例(其中轻度非典型增生21 例，中度非典型增生22 例，重度非典型增生25 例)及食管癌组34 例。

1.2 实验试剂 即用型鼠抗人Ki-67 单克隆抗体，即用型鼠抗人P53 单克隆抗体及SP 试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司，即用型兔抗人LAT1抗体购自美国Santa Cruz 公司。

1.3 免疫组化染色方法 所有标本均采用4%的中性甲醛固定，常规石蜡包埋切片、HE 染色。所有石蜡标本均经4 μm 连续切片，常规脱蜡后用SP 法染色，严格按照试剂盒说明操作，DAB 显色后，苏木素复染，脱水，透明，中性树胶封固。以PBS 代替一抗作为阴性对照，以试剂公司提供的阳性切片作为阳性对照。

1.4 染色结果判定 在排除非特异性染色的前提下，Ki-67、P53 蛋白阳性染色定位于细胞核，出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性信号。LAT1 以胞膜和胞浆中见到棕黄色颗粒分布为阳性。每张切片随机选择5 个高倍视野(×400)，每个视野计数100 个肿瘤细胞，取其平均值为细胞的阳性率。按阳性细胞所占的比例及显色深度区分:阳性细胞数所占比例＜10%为阴性(-);10%～25%为弱阳性(+)，显色浅，颗粒细;26%～50%为中度阳性(++)，显色较深;＞50%为强阳性(+++)，显色深，颗粒粗。由两名有经验的病理科医生分别进行盲法判读。

1.5 统计学方法 采用SPSS13.0 软件进行统计学分析，计数资料采用Pearson χ2检验，相关性分析采用Spearman 等级相关分析，检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 Ki-67、P53、LAT1 在食管癌及癌前病变组织中的表达 Ki-67、P53、LAT1 在正常食管黏膜组织中均无阳性表达，但在轻度非典型增生、中度非典型增生、重度非典型增生以及癌组织中均有阳性表达。Ki-67、P53、LAT1 在食管癌组织中的阳性表达显著高于癌前病变各组中的表达，其差异具有统计学意义，P ＜0.01，且Ki-67、P53、LAT1 的异常表达与组织学分级均显著相关，见表1。

表1 Ki-67、P53、LAT1 在食管癌及癌前病变组织中的表达［n(%)］Tab.1 Expression of Ki-67，P53 and LAT1 in tissues of esophageal carcinoma and precancerous lesions［n(%)］

表2 Ki-67、P53、LAT1 在食管癌中表达的相关性Tab.2 Correlation between expression of Ki-67，P53 and LAT1 in esophageal carcinoma

2.2 Ki-67、P53、LAT1 在食管癌组织中表达的相关性 Ki-67、P53、LAT1 在食管癌组织中的表达经等级相关分析结果显示，三者在食管癌组织中的表达呈正相关(r=0.428，0，596，P ＜0.01)，见表2。

3 讨论

食管癌的发生发展是多种蛋白因子相互作用的结果，涉及有丝分裂机制的激活、凋亡机制的失活等多个方面。增殖细胞核抗原Ki-67 是目前应用最为广泛的标记细胞增殖活性的指标，主要针对处于增殖周期的人类细胞核原抗体，其标记的增殖指数能够可靠地反映细胞的增殖活性，有利于预测癌变的可能性。P53 是一种重要的抑癌基因，其抗肿瘤作用主要是阻滞G1/G0 期使细胞不能进入S 期，从而抑制细胞的增殖，在诱发细胞凋亡中起到了重要作用。在所有恶性肿瘤中，50%以上会出现该基因的突变。突变型P53 蛋白半衰期延长，细胞核内出现突变型P53 蛋白的集聚，因而用免疫组化方法能够检出。有研究报道肿瘤细胞分化越差、浸润范围越广，淋巴结阳性，P53 表达水平就越高［5］。LAT1 为可溶性载体家族成员，可通过影响mTOR 通路参与细胞的生长及分化，LAT1 高表达与人类多种类型肿瘤的发生和发展密切相关，包括肺癌、乳腺癌、前列腺癌等［6-8］，并已证实在小细胞肺癌中LAT1 作为miR-126 的靶基因，与肺癌的侵袭及转移密切相关［9］。

本研究结果显示，Ki-67、P53 及LAT1 在正常食管黏膜组织中未见阳性表达，而在轻度非典型增生、中度非典型增生、重度非典型增生以及食管癌组织中，三者的阳性表达率均逐渐增高，且表达水平与组织学分级呈正相关，提示细胞增殖活性上升、P53 基因及LAT1 基因表达上调与食管癌的发生发展密切相关。同时，本研究还发现，Ki-67 与P53、LAT1 在食管癌组织中的表达呈正相关(r=0.428，0.596，P＜0.01)，这提示Ki-67 表达水平的升高可显著增加食管癌的增殖能力，而这一过程可能伴有突变型P53 基因和/或LAT1 基因的表达上调，进一步促进了细胞增殖与分化或抑制凋亡，从而加速了食管癌的发展进程。这三个指标具有作为食管癌治疗特异性靶点的潜力，同时三者联合检测有可能作为食管癌不良生物学行为的分子标志物，在食管癌早期诊断、筛选食管癌癌前高危个体等方面具有重要的临床意义。

［1］Chattopadhyay I，Phukan R，Singh A，et al.Molecular profiling to identify molecular mechanism in esophageal cancer with familial clustering［J］.Oncol Rep，2009，21(5):1135-1146.

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［3］Toyoda M，Kaira K，Ohshima Y，et al.Prognostic significance of amino-acid transporter expression (LAT1，ASCT2，and xCT)in surgically resected tongue cancer［J］.Br J Cancer，2014，110(10):2506-2513.

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