载脂蛋白E 基因启动子区多态性分布在新疆哈汉民族冠心病患者之间差异性研究①

陶社学 李金兴 雷玉艳 林 爽 (新疆医科大学研究生院，乌鲁木齐 830011)

近年来，国内外关于载脂蛋白E(APOE)启动子区多态性与冠心病(Coronary heart disease，CHD)相关性研究日益增多，但在不同人种及种群研究中，结果不尽相同，考虑可能与不同人群中APOE 基因上游转录调控区域点突变或多态性不同有关〔1，2〕。本研究从新疆汉族及新疆第二大少数民族哈萨克族出发，探讨两民族冠心病患者载脂蛋白E 基因启动子区多态性在两民族之间的分布是否存在差异。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取长期生活在新疆地区的具有一定民族代表性的哈、汉民族冠心病病人，根据冠脉造影结果及WHO 1979 年CHD 诊断标准确定冠心病组。其中符合冠心病诊断标准哈萨克族104 例，平均年龄64 岁，男性占59.26%，有冠心病、高血压病家族史者占14.8%。汉族冠心病人97 例，平均年龄65 岁，男性占62%，有冠心病家族史者占9.6%;有高血压家族史的占17.0%;其中冠心病合并高血压的患者占57.5%，冠心病合并糖尿病患者占25.6%。本研究开始前，已告知患者并得到患者及其家属知情同意。

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取ApoE 启动子区基因型的测定 采集哈、汉两民族冠心病病人空腹血液标本，ACD抗凝，蛋白酶K 消化后，酚-氯仿抽提提取DNA［3］;利用SNaPshot SNP 分型技术对所得201 个样本进行3 个SNP 位点分型。具体实验步骤:(1)电泳DNA 样本对其进行质量检查以及浓度的估计;(2)PCR 反应，PCR 引物:rs405509F:GCACAGGAAAGGACAGGGTCAG;rs405509R:CAGTCACGAGGTGGGCTGTTCT;rs449647F:TCCCTCTTGCTGAGGCTGGAGT;rs4-49647R:GCCACGTGGGCGAATCACTTA;rs7259620F:GGAGCCAGGAATGAGT-CCCAGT;rs-7259620R:GCACGGGTATGTTTGGTGA-CAA;反应体系(20 μl)包含1 ×GC Buffer Ⅰ，3.0 mmol/L Mg2+，0.3 mmol/L dNTP，1 U HotStarTaq polymerase (Qiagen Inc.)，1 μl 样本DNA 和2 μl 多重PCR 引物。再对PCR 产物进行纯化。(3)SNaPshot 多重单碱基延伸反应延伸引物:rs405509SR:TTTTTTTTTTTTTTTAGGACACCTCGCCCAGTAAT;rs449647SR:TTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCGAATCAC-TTAAGGTCAGGAG;rs7259620S-R:TTTTTTTTCCGTGGTTCAGCAGCAAGA。延伸反应体系(10 μl)包括5 μl SNaPshot Multiplex Kit(ABI)，2 μl 纯化后多重PCR产物，1 μl 延伸引物混合物，2 μl 超纯水。(4)纯化后得到的延伸产物在ABI3130XL 基因分析仪上进行测序。

1.3 统计学方法 根据测序结果确定每个标本的等位基因型或基因型频率，应用SPSS17.0 软件计算各等位基因和基因型频率的分布，组间基因型频率和等位基因频率差异比较用χ2检验，以P ＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 APOE 启动子区多态性分布 本研究中，APOE 启动子区各位点基因型及等位基因频率均符合遗传学Hardy-Weinberg 定律(P ＞0.05)，显示研究样本为遗传平衡群体。

2.1.1 APOE 启动子区基因多态性的分布在哈、汉冠心病病人中差异性研究 APOE 启动子区三个位点各基因型及等位基因在哈、汉冠心病病人中的分布情况见表1～3。结果提示新疆地区哈萨克族与汉族患者中载脂蛋白E 基因启动子区rs449647(AT)位点基因型及等位基因在两民族之间差别具有统计学意义(P ＜0.05)，见表2。rs405509(G-T)位点及rs7259620(G-A)位点基因型及等位基因在两民族之间差异均无统计学意义(P ＞0.05)，见表1、3。

表1 rs405509(G-T)位点基因型和等位基因频率分布Tab.1 Rs405509(G-T)genotype and allele's frequency distribution

表2 rs449647(A-T)位点基因型和等位基因频率分布Tab.2 rs449647(A-T)genotype and allele's frequency distribution

表3 rs7259620(G-A)位点基因型和等位基因频率分布Tab.3 rs7259620(G-A)genotype and allele's frequency distribution

3 讨论

近年有证据表明，载脂蛋白E 启动子区-219(G/T)、-427 C/T 和-491 A/T 位点多态性与心血管疾病的发生有关〔1，4-6〕。在这些区域可以在体内通过各种等位形式调控APOE 基因的表达及组织特异性，从而可能影响心血管等疾病的发病及转归。因此，APOE 基因也可能通过其转录调控区域的碱基置换改变ApoE 蛋白的表达量，从而增加对心血管疾病严重程度的影响［5，6］。

本研究从汉族及新疆第二大少数民族哈萨克族出发，结果发现在两民族冠心病病人之间APOE 启动子区rs449647(A-T)位点基因型及等位基因之间差别有统计学意义，提示该位点可能在两民族之间存在差异，这与李光荣等［7］关于载脂蛋白E 启动子区SNP 的分布及频率与种族和地域因素有关的研究结论相一致，哈萨克族以游牧民族为主，注重高盐、高脂，导致饮食中高热量饮食的摄入增加，使APOE 基因上游转录调控区域发生点突变或多态可能性增加，从而改变ApoE 蛋白的表达量，在一定程度上影响脂代谢，加速了动脉粥样硬化病变的过程，导致CHD 的发生。其他两个位点在两民族之间差别均无统计学意义，究其原因而言一方面可能是久居新疆的汉族在饮食、环境等方面与当地少数民族相似，造成二者之间无差异的可能，也可能与本研究所选样本代表性欠佳及样本量不够大有关，还应进一步扩大样本含量及提高样本代表性，使本研究准确性达到更高的水平，进而可以从分子生物学水平进一步了解同一地区不同民族之间冠心病发病的危险因素以及积极因素，起到预防疾病的作用。

本研究仅仅从rs405509(G-T)、rs449647(AT)、rs7259620(G-A)位点出发，选择范围较为局限，不能排除ApoE 基因转录调控区可能有其他的SNP影响ApoE 基因的表达，在以后的研究中可继续扩大研究区域，寻找其他可影响ApoE 基因表达的SNP。

［1］Banares VG，Ariel Bardach，Graciela Peterson，et al.APOE -249T allele may reduce the risk of atherosclerotic lesions among middleaged women［J］.Mol Cell Biochem，2012，362:123-131.

［2］Ozturk Z，Enkhmaa B，Shachter NS，et al.Integrated role of two apoliprotein E polymorphisms on apolipoprotein B levels and coronary artery disease in a biethnic population［J］.Metab Syndr Relat Disord，2010，8(6):531-538.

［3］严冰冰，虞 涛，方华红，等.应用实时荧光PCR 分析apoE3、4等位基因［J］临床检验杂志，2008，26(3):197-199.

［4］Lambert JC，Brousseau T，Myllykangas L，et al.Independent association of an APOE gene promoter polymorphismwith increased risk of myocardial infarction and decreased APOE plasma concentrations-the ECTIM study［J］.Hum Mol Genet，2000，9:57-61.

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［6］Shu Ye，Louise Dunleavey，Wendy Bannister，et al .Independent effects of the -219G ＞T and e2/e3/e4polymorphisms in the apolipoprotein E gene on coronary artery disease:The Southampton Atherosclerosis Study［J］.Eur J Human Genetics，2003，11:437-443.

［7］李光荣，赵明祥.载脂蛋白E 基因启动子-307～-7 区单核苷酸论著多态性与散发阿尔茨海默病的相关研究［J］.临床和实验医学杂志，2010，9(10):721-722.