强直性脊柱炎患者外周血中miR-17、miR-181、miR-106、miR-30 和miR-495 表达的分析①

刘 鑫 魏 军 杨芝红 周林林 郑锡铭 徐广贤 (宁夏医科大学检验学院，银川 750004)

强直性脊柱炎(Ankylosing spondylitis，AS)，是一种主要侵蚀脊柱累及骶髂关节的慢性炎症性疾病。炎症可以累积滑膜关节、软骨关节、肌腱以及韧带附着于骨的部位，属于血清阴性脊柱关节炎。其有较高的致畸性和致残性。其发病机制目前尚不明确，有报道其与遗传、免疫以及细菌感染等因素有关。目前的诊断主要依赖于临床症状及影像学资料。而临床上，一些病程短，病情较轻的患者可能不能够得到及时诊断。HLA-B27 在AS 病因和发病机制中起到一定作用，但其也受到一些因素的影响。目前有研究表明，miR-16、miR-221 和let-7i 在AS 患者T 细胞中表达量增高［1］微小RNA(microRNA)是一种存在于多种生物体内可以调控基因表达的内源性非编码小分子RNA，长约19～25 个核苷酸［2］。microRNA 是一类内源性的小片段非编码RNA，主要作用于转录后水平，通过抑制mRNA 的翻译来参与调控机体细胞的增殖、分化、代谢、凋亡等一系列生物学活动［3］。现阶段关于microRNA 的研究已证明，microRNA 在免疫调节阶段发挥重要作用［4］，其与炎症、信号通路传导也有密切关系，miRNAs 在冠状动脉疾病、癌症、自身免疫性疾病患者的血液中差异性的表达［5，6］。miRNAs 对基因调控具有高度特异性，miRNAs 的表达异常能够预示着与疾病有关的调控过程发生异常。通过近年来的研究，许多疾病的miRNA 表达谱得到证实，由于疾病中存在这些特异性的miRNAs，人们提出miRNAs 可能会作为一种新型的特异性诊断标志物［7］。我们通过生物信息学分析强直性脊柱炎与microRNAs 的关系发现，miR-17、miR-106、miR-181、miR-495 和miR-30 可靶向调控HLA-B、IL-1、TLR-4、HLA-B、DVL、GSK/3β等与强直性脊柱炎发病相关的基因(如图1)，因此我们推测microRNA 可能通过靶向调控这些基因来参与调控强直性脊柱炎的发生发展，本研究以AS 患者外周血单个核细胞为研究对象，探求miR-17、miR-106、miR-181、miR-495 和miR-30 表达水平，为强直性脊柱炎发病机制和临床诊断中新的标志物提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 研究对象 临床样本为宁夏医科大学总医院自2012 年10 月至2013 年10 月收治的门诊病人61例，其中男性34 例，女性27 例。年龄14～78 岁，平均(33.06±13.96)岁。AS 患者的诊断均符合美国风湿病学会1987 年修改的AS 纽约标准，且均为HLA-B27 阳性患者。此外，随机选取31 例同一时期本院体检的健康者，作为本研究的对照组，其中男性12 例，女性19 例，年龄为20～64 岁，平均(31.22±11.93)岁。选取的研究对象均排除自身免疫性疾病和重要器官系统疾病。以上样本的收集均获得患者同意及医院伦理委员会同意。

1.2 主要材料与试剂 Ficoll 分离液(Sigma 公司);RNAiso for Small RNA(TaKaRa 公司，大连);T1 Cloning Kit 试剂盒，反转录试剂盒，Top Green qPCR SuperMix(北京全式金公司);质粒小提试剂盒，DNA凝胶回收试剂盒(天根生化科技有限公司);引物合成与DNA 测序由北京三博远志生物技术有限公司完成。

图1 利用生物信息学软件预测出与AS 相关的miRNAsFig.1 miRNAs associated with AS predicted by using of bioinformatics software

表1 所用茎环反转录引物Tab.1 List of primer sequences used for reverse transcription

1.3 方法

1.3.1 样本的收集、单个核细胞分离及Small RNA的提取 收集空腹静脉血5 ml，放置于EDTA 抗凝管中，采取Ficoll 分离液，利用密度梯度离心法分离单个核细胞，向提取的单个核细胞中加入1 ml RNAiso 试剂充分裂解细胞，按照RNAiso for Small RNA 试剂盒说明书提取Small RNA，最后加入50 μl的RNase-free 水溶解沉淀。

1.3.2 cDNA 的合成 取2 μl 已提取的Small RNA，使用特异性茎环引物(见表1)，参照全式金公司的反转录试剂盒说明书进行cDNA 合成，反转录条件为42℃30 min，85℃5 min。

1.3.3 标准曲线的构建 以cDNA 为模板，特异性上游引物(见表2)，通用下游引物(5'-3':CTCAACTGGTGTCGTGGA)。进行PCR 扩增，2.5%琼脂糖电泳，将正确的回收片段与T 载体连接，参照全式金T载体构建说明书。构建好的T 载体，经测序成功后，按照10 倍稀释法，进行倍比稀释，各取标准质粒2 μl 作为模板，构建标准曲线。

1.3.4 miRNAs 表达量的检测 使用qTOWER2.0实时定量PCR 仪，反应体系采用全式金Top Green q PCR SuperMix 说明提供的反应体系:Top Green q PCR SuperMix 10 μl，PCR 上下游引物各0.4 μl，模板2 μl，加ddH2O 至20 μl。反应条件为:94℃30 s 1 循环;94℃5 s，60℃15 s，72℃10 s 40 循环;实验设置3 个平行复孔，取平均值。并以双标准曲线的相对定量法进行qPCR 定量分析，以人U6 作为内参，上游序列为:CTCGCTTCGGCAGCAC;下游序列为:AACGCTTCACGAATTTGCGT。

表2 所用Real-time PCR 检测引物Tab.2 List of primers used for q RT-PCR

1.4 统计学分析 数据分析采用SPSS17.0 统计软件处理，数据分析采用±s 表示，两组均数比较采用独立样本t 检验，P ＜0.05 即表示存在显著差异。

2 结果

2.1 miRNAs Real-time PCR 标准曲线的构建 PBMC 中提取的small RNA，使用RT-PCR 技术对miR-17、miR-181、miR-106、mir-30 及mir-495 特异性扩增后，产物用2.5%琼脂糖凝胶电泳，获得65 bp 左右的目的条带。使用miR-17、miR-181、miR-106、miR-3 及miR-495T 载体质粒，进行Real-time PCR 扩增，并构建标准曲线，构建的标准曲线R2=0.99(图2)，可用于后续检测。

2.2 miR-17、miR-181、miR-106、miR-30、miR-495 Real-time PCR 结果 分别对100 例临床样本中的miR-17、miR-181、miR-106、miR-30、miR-495 的表达量进行Real-time PCR 检测，检测结果表明与正常人相比，在强直性脊柱炎患者外周血中表达上调的有miR-106(P ＞0.05)与miR-30(P ＞0.05);表达下调的有miR-181(P ＜0.05)、miR-495(P ＜0.05)和miR-17(P ＞0.05)，其中miR-181 和miR-495 有统计学意义。

图2 miRNAs 的标准曲线及92 例外周血样本miRNAs 的表达量散点图Fig.2 Standard curve of miRNAs and miRNAs expression of 92 cases of peripheral blood samples

表3 miR-17、miR-106、miR-181、miR-495、miR-30 荧光定量PCR 结果(±s，n=92)Tab.3 List of miR-17，miR-106，miR-181 expression profile determined by miR-17，miR-106 and miR-181(±s，n=92)

表3 miR-17、miR-106、miR-181、miR-495、miR-30 荧光定量PCR 结果(±s，n=92)Tab.3 List of miR-17，miR-106，miR-181 expression profile determined by miR-17，miR-106 and miR-181(±s，n=92)

Note:1)P ＜0.05.

3 讨论

强直性脊柱炎(AS)是以骶髂关节及脊柱附着点炎症为主要临床症状的疾病。属风湿病范畴，是一种全身慢性炎性疾病，目前该病的发病机制尚不明确，目前研究发现与机体免疫功能异常密切相关，而T 细胞的免疫功能异常更是得到了广泛的关注［8］。Li 等〔9〕研究发现，miR-181 在较成熟的T 细胞中，特别是CD4+CD8+T 细胞中表达增高，而miR-181 表达下降能够降低细胞对抗原的敏感度。miR-181 在T 细胞发挥作用过程中起到重要作用，miR-181 表达水平的改变可能引起自身免疫性疾病的发生。在小儿系统性红斑狼疮患者外周血单核细胞中通过qRT-PCR 检测miR-181 的表达水平，发现其较对照组表达下调，且引起其靶基因PCAF 的表达量增高［10］。我们通过qRT-PCR 检测HLA-B27 阳性的强直性脊柱炎患者外周血PBMC 中miR-181 的表达量，发现较正常对照组显著下调(P ＜0.05)。在人类骨髓间充质干细胞中，miR-495 通过靶向Sox9 抑制软骨分化过程［11］。miR-495 在肿瘤中的作用也已有广泛的报道，其可以靶向MTA3，在非小细胞肺癌中起到调节增殖和凋亡的作用［12］。我们的实验结果表明，miR-495 的表达量存在着显著的下调(P ＜0.05)，而其广泛的下调可能与疾病的免疫功能异常，炎症反应等存在着密切的关系。对于在强直性脊柱炎成骨细胞形成过程中起到重要作用的 Wnt/β-catenin 通 路，通 过 Targetscan、microrna.org 在线数据库预测到miR-495 可以靶向该通路的DVL 和GSK/3β 等多个蛋白;miR-181、miR-495还可以同时靶向TLR-4、HLA-B 等与AS 发病相关基因。

与正常人相比在强直性脊柱炎患者外周血中miR-181 和miR-495 的表达量存在差异，它们可以靶向调控TLR-4、HLA-B、DVL 和GSK/3β 等基因，这些靶向作用与AS 的发病机制之间的关系尚需要后期的实验进一步验证，这一发现可能为强直性脊柱炎发病机制的研究提供新的思路，成为临床诊断中新的标志物。

［1］Zhao H，Shen J，Medico L，et al.A pilot study of circulating miRNAs as potential biomarkers of early stage Breast cancer［J］.PLoS One，2010，5(10):1-12.

［2］Tang G，Tang X，Mendu V，et al.The art of microRNA:various strate-gies leading to gene silencing via an ancient pathway［J］.Biochim Bio-phys Acta，2008，1779:655-662.

［3］Bushati N，Cohen SM.microRNA Functions［J］.Annu Rev Cell Dev Biol，2007，23(1):175-205.

［4］Gracias DT，Katsikis PD.MicroRNAs:key components of immune regulation［J］.Adv Exp Med Biol，2011，780:15-26.

［5］Fichtlscherer S，De Rosa S，Fox H，et al.Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease［J］.Circ Res，2010，107(5):677-684.

［6］Illei GG，Tackey E，Lapteva L，et al.Biomarkers in systemic lupus erythematosus.I.General overview of biomarkers and their applicability［J］.Arthritis Rheum，2004，50(6):1709-1720.

［7］Lai NS，Yu HC，Chen HC，et al.Aberrant expression of microRNAs in T cells from patients with ankylosing spondylitis contributes to the immunopathogenesis［J］.Arthritis Rheum，2013，173(1):47-57.

［8］Curotto de，Lafaille MA，Lafaille JJ.CD4 (+)regulatory T cells in autoimmunity and allergy［J］.Curr Opin Immunol，2002，14:771-778.

［9］Li QJ，Chau J，Ebert PJ，et al.miR-181a is an intrinsic modulator of T cell sensitivity and selection［J］.Science，2004，303(5654);83-86.

［10］延佳佳，朱晓明.MicroRNA-181a 研究进展［J］.Chin J Clinicians (Electronic Edition)，2013，7(12):5449-5451.

［11］Lee S，Yoon DS，Paik S.MicroRNA-495 inhibits chondrogenic differentiation in human mesenchymal stem cells by targeting sox9［J］.Stem Cells Dev，2014，23(15):1798-1808.

［12］Chu H，Chen X，Wang H，et al.MiR-495 regulates proliferation and migrationin NSCLC by targeting MTA3［J］.Tumour Biol，2014，35(4):3487-3494.