基于不同载体制备黄芪甲苷人工抗原的研究①

徐加兵 于生兰 欧阳臻 洪伟鸣 (江苏大学药学院，镇江212013)

黄芪(Radix Astragali)是豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根，是中医补气的要药。由于其多种有益机体的功效，现已有不少黄芪制成的药品及功能食品投放市场。黄芪甲苷(Astragaloside Ⅳ，简称AST)是中药黄芪药理活性的主要物质之一，为黄芪及其制剂质量鉴定的重要指标［1］。目前常用的黄芪甲苷检测方法或者操作步骤较为复杂，灵敏度低，或者分析成本高，耗时长［2］。免疫检测作为一种筛选检测技术，具有高灵敏度和操作方便等优点，而获得特异性强、灵敏度高的抗体是建立一种准确可行的免疫检测方法的关键。AST 分子量小，是典型的半抗原，需结合一个合适的载体蛋白分子后才具有免疫原性［1］。相关文献表明不同的载体蛋白对人工抗原免疫小鼠后产生的抗体的灵敏度和特异性有较大影响。因此要获得特异性强，灵敏度高的抗体，选择一种合适的蛋白作为合成人工抗原的载体是一项必不可少的研究。牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)和匙孔型血蓝蛋白(Keyhole limpet hemocyanin，KLH)是两种常用的蛋白载体［3］。本研究利用BSA 和KLH 两种载体蛋白合成黄芪甲苷人工抗原，通过比较免疫小鼠抗血清的特异性，对两种不同载体免疫原的免疫原性进行比较。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 AST 标准品(含量98%，HPLC)，成都曼思特生物科技有限公司;牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)、弗式完全佐剂(FCA)、弗式不完全佐剂(FICA)，Sigma 公司;羊抗鼠酶标抗体、TMB 单组份显色剂，美国Pierce 公司;甲醇、NaIO4均为分析纯。全自动多功能酶标仪、自动洗板，美国布鲁克·道尔顿有限公司;MALDITOF/TOF 质谱仪(Applied Biosystem，4800 普通型)。

1.2 动物 BALB/c 小鼠，雌性，6 只，SPF 级，6 周龄，体重16～18 g，扬州大学实验动物中心提供。

1.3 人工抗原的合成 溶液配制:将AST 溶于80%甲醇中配成浓度约为3 mg/ml 的溶液取1.7 ml。称取2.6 mg NaIO4溶于0.5 ml 蒸馏水中。AST氧化:用0.1 ml 注射器将AST 溶液缓缓滴加至NaIO4溶液中，室温反应4 h。除去多余高碘酸钠:慢慢往上述反应液中滴加乙二醇4 ml 室温反应2 h，以终止反应除去过量的NaIO4防止蛋白载体变性。与蛋白偶联:称取5 mg BSA 溶于1 ml 碳酸盐缓冲液(pH=9.6)中，将经NaIO4氧化后的AST 溶液缓缓滴加到BSA 溶液中。封闭避光反应6 h，移至透析袋中，先用PBS 透析，再逐渐降低PBS 浓度至最后以蒸馏水透析，透析72 h。AST-KLH、ASTOVA 的合成方法同上［4］。

1.4 人工抗原的鉴定

1.4.1 紫外全波长扫描法鉴定AST-BSA、ASTKLH、AST-OVA 将半抗原AST、载体蛋白(BSA、KLH、OVA)以及人工抗原，配制成一定浓度的溶液，在200～400 nm 波长下进行紫外扫描，比较人工抗原紫外吸收曲线与游离半抗原、载体蛋白差异［2，4］。

1.4.2 飞行时间质谱法鉴定AST-BSA 偶联比 经ZipTip C4 脱盐处理后取1 μl 蛋白样品点至样品靶位上，自然干燥后，再取0.6 μl SA 基质溶液点至对应的靶位上并自然干燥，用相同方法在样品靶位相邻位置点标准品。在正离子模式下选择线性方法对样品测试范围进行校准测试然后对样品AST-BSA的分子量进行测定。根据分子量测定结果，计算偶联比。偶联比=(MrAST-BSA-MrBSA)/MrAST。

1.4.3 紫外吸收法测定AST-KLH 的偶联比 由于KLH 的相对分子量较大，不能通过时间飞行质谱检测AST-KLH 的偶联比，故采用在紫外吸收法测定AST-KLH 的偶联比，方法如下:先用甲醇精确配制不同浓度的AST 和KLH 标准溶液，然后将AST-KLH 稀释到适当浓度后用紫外分光光度计测出AST、ASTKLH 在最大吸收波长处的吸光值，在此基础上分别测定偶联物中AST 和载体蛋白的偶联比，采用Lowry法计算出偶联物中蛋白质含量。半抗原与蛋白质结合比的计算公式为:偶联比=(AST 质量浓度/AST 相对分子质量)/(载体蛋白的质量浓度/载体蛋白的相对分子质量)［5］。

1.5 动物免疫及抗体血清检测 选择15 只小鼠，随机分成三组，每组5 只，标记为组一、组二、组三。组一5 只小鼠以AST-KLH 免疫，组二中5 只小鼠以AST-BSA 免疫，组三中5 只小鼠以生理盐水混合佐剂注射作为空白对照。免疫方法如下:首次免疫，取一定蛋白浓度的免疫抗原(AST-BSA、AST-KLH)加入等体积弗氏完全佐剂，乳化完全，对小鼠进行皮下多点注射免疫。每只小鼠每次注射100 μl，含100 μg的免疫原(按蛋白含量计算)。2 周后，第一次加强免疫(方法同首免);2 周后，第二次加强免疫(将首免的弗氏完全佐剂换为弗氏不完全佐剂，其余同首免);1 周后眶窝静脉丛采血，将所采得的血液于37℃水浴放置2 h 后，于4 000 r/min 离心10 min，取上清液备用［6］。分别用AST-OVA、ASTKLH 作包被抗原，间接酶联免疫吸附法(indirect enzyme-linked immunosorbent assay，iELISA)检测ASTBSA 免疫小鼠抗血清抗体效价，AST-KLH 免疫鼠抗血清分别采用AST-OVA 和AST-BSA 作包被抗原检测。采用间接竞争酶联免疫吸附试验(indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay，icELISA)对多抗血清与AST 进行抑制试验［7］，在进行icELISA 时同样使用除免疫抗原外的两种不同人工抗原包被。

2 结果

2.1 黄芪甲苷人工抗原的鉴定 黄芪甲苷、载体蛋白和人工抗原的紫外吸收曲线见图1。AST、BSA 出峰值的对应波长分别为200 nm 和230 nm 左右。AST-BSA 峰左移，对应波长在210 nm 左右，证明偶联成功。同样KLH 出峰值的波长为280 nm 左右。AST-KLH 峰左移，对应波长为215 nm 左右，证明偶联成功。

图1 抗原紫外全波长扫描图Fig.1 Identification of antigen by ultraviolet wavelength scanning

图2 AST-BSA 飞行时间质谱鉴定图Fig.2 Identification of AST-BSA and BSA by MALDI TOF MS

2.2 偶联比的确定 BSA 标准品及AST-BSA 偶联物的飞行时间质谱图见图2。按照公式:偶联比=(MAST-BSA-MBSA)/MAST，计算的偶联物AST-BSA 的偶联比为13∶1。分别测定AST 和AST-KLH 的吸光度，其中AST 的A210=0.8，KLH 的A280=1.2，ASTKLH 的A280=1.5，按文献［5］的计算公式ASTKLH 的偶联率为15，符合文献［8］推荐的理想范围8～25.1内。

2.3 抗体滴度测定 测定之前采用棋盘方阵法测定最佳抗原包被浓度约为4 μg/ml，分别以ASTKLH、AST-OVA 包被酶标板，采用倍比稀释法检测AST-BSA 免疫的小鼠的多抗血清效价，结果如图3所示。由图可知，两种人工抗原免疫小鼠所得的血清抗体效价均在1∶512 00 以上，AST-BSA 免疫的小鼠血清抗体效价略高，表明本实验所制备的两种人工抗原均能刺激小鼠产生抗体。

2.4 抗体特异性鉴定 以4 μg/ml AST-OVA 作为包被抗原包被酶标板，以AST 为竞争抑制剂进行间接竞争抑制ELISA 实验，结果图4 所示。从图中可知，AST-BSA 免疫的小鼠的多抗血清特异性较差;AST-KLH 免疫的小鼠的多抗血清特异性较强，IC50 最小剂量可达5μg/ml，可见AST-KLH免疫的小鼠的多抗血清具有很好的特异性。

图3 两种人工抗原免疫的小鼠血清效价检测Fig.3 Titer of serum of mice immunized by two artificial antigens

图4 抗体异性检测结果Fig.4 Detection of specificity of antibodies

3 讨论

本实验以BSA、KLH 两种不同蛋白为载体成功合成了黄芪甲苷(AST)的人工抗原，抗原偶联比均在文献推荐范围内，保证了合成抗原免疫原性强，能产生针对AST 的抗体［8］。用两种人工抗原免疫小鼠，结果均获得了效价较高的多抗血清。其中ASTKLH 免疫的小鼠血清效价较之AST-BSA 免疫的小鼠略低，分析原因可能是BSA 是哺乳动物的血清白蛋白，而KLH 是无脊椎动物的血蓝蛋白，相比而言BSA 与哺乳动物小鼠的亲缘性要强，蛋白本身产生的免疫性要弱，故产生的抗体多是针对AST 的抗体;而KLH 与小鼠亲缘性较弱蛋白本身的免疫原性要强，产生的抗体有一部分是针对KLH 的。但是用AST-KLH 免疫的小鼠产生的抗体的特异性较之AST-BSA 免疫小鼠所获得的抗体血清要强，导致这种差异的可能原因如下:第一，理论上KLH 上有更多的抗原结合位点，AST-KLH 刺激机体产生免疫反应时，AST 的暴露面与机体接触的几率更大［9］。第二，AST-BSA 乳化注射小鼠会经历一个蛋白结构外翻并再于体内复性的过程，复性后的蛋白可能和天然蛋白的结构不尽相同，而KLH 不存在这个过程，故产生的抗体具有更强的特异性［10，11］。本试验根据AST 有多个邻羟基结构存在的结构特点，选用高碘酸钠法合成抗原，结果证明合成是成功的，方法是可行的。通过比较不同人工抗原免疫小鼠所产生的抗体性质可以看出，KLH 作为蛋白载体合成的人工抗原所产生的抗体特异性更强并且抗体的特异性和人工抗原的蛋白载体有较大联系。因此选择一种合适的载体蛋白是制备人工抗原的先决步骤。同时本实验成功制备了对AST 特异性较强的抗血清，为进一步研究和建立黄芪甲苷的免疫学检测方法奠定了基础。

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