喉癌来源黑色素瘤抗原A3 在小鼠黑色素瘤细胞模型的表达①

李 宁 吉晓滨 谢景华 刘启才 (广州市第一人民医院耳鼻咽喉科，广州 510180)

黑色素瘤抗原A3 基因隶属黑色素瘤抗原家族，除睾丸、胎盘外，在其他正常组织中不表达。它所编码的蛋白可被细胞毒性T 淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes，CTLs)识别和杀伤［1］，但睾丸、胎盘生殖细胞不表达MHCⅠ/Ⅱ类分子，不能递呈MAGE抗原，表达MAGE-A3 抗原的生殖细胞不会诱导体内的免疫应答［2］，并且MAGE-A3 在多种肿瘤如黑色素瘤、舌癌、食管癌、多发性骨髓瘤、甲状腺癌、非小细胞肺癌、神经母细胞瘤、肝癌、胃癌、结直肠癌、骨肉瘤、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、白血病和淋巴瘤等，都有较高程度的表达［3-8］，喉癌也不例外［9］，因此，MAGE-A3 抗原具有肿瘤涵盖类型广、特异性强的特点，被认为是癌-睾丸抗原的典型代表，可作为特异性免疫拮抗的理想靶点及肿瘤辅助诊断、预后提示的指标。

小鼠黑色素瘤B16 细胞是应用较广的一种肿瘤模型细胞，体外培养能稳定传代，能有效接种实验动物体内形成移植性肿瘤模型。用于研究肿瘤的发生、转移过程，及影响肿瘤发展、转移的免疫学、病理学参数［10］。

基于MAGE-A3 喉癌中的较高表达，我们将先期构建喉癌组织MAGE-A3 基因的pIRES2-EGFP/MAGE-A3 真核表达质粒载体包裹后，通过脂质体将MAGE-A3 基因导入到小鼠黑色素瘤B16 细胞内，通过G418 筛选，建立表达MAGE-A3 抗原的B16 肿瘤细胞模型。该细胞模型具备B16 细胞生物的特性，同时能表达MAGE-A3 抗原。这为以后能以该细胞模型为基础，通过体外、体内实验，寻求药物或方法来抑制、杀灭表达MAGE-A3 抗原的肿瘤细胞或组织，特别是研究MAGE-A3 在喉癌免疫治疗中的作用，奠定了实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂 小鼠黑色素瘤B16 细胞系购自莱德尔公司。pIRES2-EGFP/MAGE-A3 真核表达质粒先期由广州医科大学实验医学研究中心构建。脂质体转染试剂盒Lipofectamine LTX 及Plus 试剂、OPTI-MEM 培养基为Invitrogen 公司产品，DNA marker、Trizol 及RT-PCR 试剂盒为Takara 公司产品，G418、质粒提取试剂盒、DNA 纯化试剂盒购自Qiagen 公司，Brilliant ⅡSYBR Green QPCR Master Mix 购自Stragene 公司，限制性内切酶XhoⅠ、EcoRⅠ购自New Eenlang Biolabs 公司。

1.2 pIRES2-EGFP/MAGE-A3 真核表达质粒的鉴定 用质粒提取试剂盒提取大肠杆菌中pIRES2-EGFP/MAGE-A3。提取的质粒纯化后进一步用XhoⅠ、EcoR Ⅰ双酶切，然后做1% 琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.3 pIRES2-EGFP/MAGE-A3 转染B16 细胞 B16细胞分实验组、未转染组，每组3 个复孔。用含双抗10%胎牛血清的1640 培养液常规培养B16 至对数生长期，消化后做细胞计数。在6 孔培养板内每孔加入5 ×106个细胞，培养至细胞70%～80%铺满孔底时进行转染。转染前，取EP 管两个，一个EP 管中用375 μl OPTI-MEM 培养基溶pIRES2-EGFP/MAGE-A3 真核表达质粒7 500 ng，同时加Plus 试剂7.5 μl;另一管用375 μl OPTI-MEM 培养基溶Lipofectamine LTX 22.5 μl。两者各自混匀后，将一EP管溶液移至另一管中，混匀，室温孵化5 min。用无血清1640 培养液洗涤孔板中细胞。实验组每孔加入脂质体质粒混合溶液250 μl 及OPTI-MEM 培养基2 250 μl，共3 孔，对照组直接加入OPTI-MEM 培养基2 250 μl，共3 孔。5 h 后，换成含双抗10%胎牛血清的1640 培养液培养。转染后24 h，用荧光显微镜观察转染情况。而后用含800 μg/ml G418 的1640 培养基筛选，直至对照孔未转染细胞完全死亡。筛选的阳性克隆用含200 μg/ml G418 的1640培养。

1.4 B16 阳性克隆EGFP 表达的检测 转染24 h后，更换实验组6 孔板中培养基，用荧光显微镜在蓝光下激发B16 阳性克隆EGFP，观察绿光荧光蛋白含量、强度。用含G418 的1640 培养基筛选20 d后，再次检测。

1.5 B16 阳性克隆MAGE-A3 总RNA 的提取及检测 用含G418 的1640 培养基筛选20 d 后，从实验组和未转染组的6 孔板中随机各取一孔，消化后吸取相同细胞数于EP 管中，离心后每管加入1 ml Trizol，室温放置5 min，待其充分裂解。12 000 r/min离心5 min，弃沉淀后加入氯仿200 μl，振荡混匀，室温放置15 min。4℃12 000 r/min 离心10 min。吸取上层水相移至另一EP 管。管中加异丙醇0.5 ml，混匀，室温孵育5 min。4℃12 000 r/min 条件下离心10 min，弃上清，RNA 沉于管底。管中加入75%乙醇1 ml，温和振荡，悬浮沉淀。4℃条件下8 000 r/min 离心5 min，弃上清。室温晾干至RNA沉淀变透明。用30 μl RNase Free dH2O 溶解RNA沉淀。测定RNA 浓度及OD260/280值。提取RNA 在1.5%琼脂糖凝胶上电泳观察RNA 质量，电压设定为110 V。

1.6 B16 阳性克隆MAGE-A3 总RNA 反转录为cDNA 提取的B16 阳性克隆MAGE-A3 总RNA 用TaKaRa primeScript RT-PCR Kit 进行反转录。在Microtube 管中配制混合液:dNTP Mixture(10 mmol/L each)1 μl、Oligo dT Primer(2.5 μmol/L)1 μl、Template RNA 500 ng，用RNase Free dH2O 配成总体积为10 μl 体系，然后在PCR 仪上65℃5 min 进行变性、退火反应。反应后，在Microtube 管中配制反转录反应液:上述变性、退火后反应液10 μl、5 ×PrimeScript Buffer 4 μl、RNase Inhibitor(40 U/μl)0.5 μl、PrimeScript RTase(for 2 Step)0.5 μl、RNase Free dH2O 5 μl，总体积20 μl，然后在PCR 仪上按30℃10 min、46℃30 min、95℃5 min 进行反转录反应。

1.7 B16 阳性克隆MAGE-A3 mRNA 表达水平的检测 将反转录合成的cDNA 作为模板，设计MAGEA3 和内参照GAPDH 基因的引物，序列分别为:MAGE-A3 正义链 5 '-GTACATCTTTGCCACCTGC CTG-3'，反义链5'-CTCTTGCGATTATGGTCCAGGAC-3';GAPDH 正义链5'-TGGTGCCAAAAGGTCAT-3'，反义链5'-TCACACCCATCACAAACATG-3'。序列提交给TaKaRa 公司进行引物合成。荧光定量PCR 按SYBR Green Kit(Stratagene)说明书建立20 μl 体系，包括:SYBR Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)(2 ×)10 μl、ROX Reference Dye(50 ×)0.4 μl、2 μm 引物(正义链+反义链)3 μl、cDNA 1 μl、RNase Free dH2O 5.6 μl。在Stratagene 的M3000P 上进行，反应条件为:95℃30 s;然后95℃5 s、56℃30 s 及72℃30 s，共40 个循环;最后95℃1 min。每个循环的第二步完成后检测荧光信号。

2 结果

2.1 pIRES2-EGFP/MAGE-A3 真核表达质粒的鉴定 转化菌质粒用XhoⅠ、EcoRⅠ双酶切，琼脂糖凝胶电泳可见约957 bp 的目的片段、5.3 kb 的载体片段(图1)，表明先期成功地构建了MAGE-A3 的真核表达载体pIRES2-EGFP/MAGE-A3。

2.2 B16 细胞EGFP 表达的检测 用Lipofectamine LTX 脂质体包裹pIRES2-EGFP/MAGE-A3 真核表达质粒，转染B16 细胞24 h 后，荧光显微镜观察B16阳性克隆EGFP，见表达含EGFP 的细胞散在分布，用荧光显微镜观察示其荧光较弱(图2、3)，表明pIRES2-EGFP/MAGE-A3 真核表达质粒已转染到B16 细胞内，EGFP 在B16 细胞内有表达。由于MAGE-A3 和EGFP 基因从一个单一的双顺反子mRNA 中被翻译，EGFP 表达表明MAGE-A3 蛋白有表达。

图1 重组载体pIRES2-EGFP/MAGE-A3 经Xho Ⅰ、EcorR Ⅰ双酶切后的电泳图Fig.1 Electrophoretogram of recombinant vector pIRES2-EGFP/MAGE-A3 digested by Xho Ⅰand EcorR Ⅰenzymes

图2 pIRES2-EGFP/MAGE-A3 真核表达质粒转染小鼠黑色素瘤B16 细胞后24 h(荧光显微镜×200)Fig.2 After pIRES2 EGFP/MAGE-A3 eukaryotic expression plasmid was transfected mouse melanoma B16 cells in 24 h (fluorescence microscope，×200)

图3 pIRES2-EGFP/MAGE-A3 真核表达质粒转染小鼠黑色素瘤B16 细胞后24 h(普通显微镜，×200)Fig.3 After pIRES2 EGFP/MAGE-A3 eukaryotic expression plasmid was transfected mouse melanoma B16 cells in 24 h (general microscope，×200)

用含800 μg/ml G418 的1640 培养基进行筛选20 d 后，可见数个阳性克隆，荧光显微镜观察，见荧光比例增加、荧光强度增强(图4、5)，表明经G418筛选后，未获得pIRES2-EGFP/MAGE-A3 真核表达质粒细胞因缺乏氨基糖苷磷酸转移酶，而被G418 杀灭，剩下的绝大多数为成功转染pIRES2-EGFP/MAGEA3 真核表达质粒后具有表达氨基糖苷磷酸转移酶的细胞，表明MAGE-A3 基因在绝大多数细胞中表达，通过有丝分裂将MAGE-A3 基因传递给后一代，所呈现出EGFP 荧光强度较前增加，数目增多，荧光数的增多，表明转染能表达EGFP 荧光蛋白的细胞增多，因该蛋白基因与MAGE-A3基因在同一单一的mRNA中编码，表明MAGE-A3 蛋白表达也增加。间接表明B16 阳性克隆EGFP 表达细胞能稳定表达。

图4 用含G418 的1640 培养基筛选经pIRES2-EGFP/MAGE-A3 真核表达质粒转染的小鼠黑色素瘤B16细胞20 d 后(荧光显微镜，×200)Fig.4 After B16 cells transfected with pIRES2-EGFP/MAGE-A3 eukaryotic expression plasmid were screened with 1640 medium containing G418 in 20 days(fluorescence microscope，×200)

图5 pIRES2-EGFP/MAGE-A3 真核表达质粒转染小鼠黑色素瘤B16 细胞20 d 后(普通显微镜，×200)Fig.5 After pIRES2 EGFP/MAGE-A3 eukaryotic expression plasmid was transfected mouse mela-noma B16 cells in 20 days(general microscope，×200)

2.3 B16 阳性克隆MAGE-A3RNA 纯度及完整性的鉴定 用RNase Free dH2O 溶解RNA 沉淀，通过分光光度计测下列各组OD260/280值:①未转染组，②pIRES2-EGFP/MAGE-A3 重组质粒组。两组的OD260/280分别是1.98、2.01，均在1.9～2.1 之间，可以认为RNA 纯度较好。RNA 完整性见琼脂胶电泳图(图6)。

2.4 荧光定量RT-PCR 鉴定MAGE-A3 在B16 细胞中的表达 用荧光定量RT-PCR 对各实验组中的MAGE-A3、GAPDH 基因的mRNA 进行检测，得到:①空白组中的GAPDH、MAGE-A3 扩增的Ct 值分别为13.97、28.49，△Ct1=14.52;②pIRES2-EGFP/MAGE-A3 重组质粒组中的GAPDH、MAGE-A3 扩增的Ct 值分别为13.98、26.53，△Ct2=12.55;采用2-△△Ct法相对定量分析，以空白组为对照，△△Ct=△Ct2-△Ct1=-1.97，相对定量值2-△△Ct=3.92，也就是说pIRES2-EGFP/MAGE-A3 重组质粒组是空白组MAGE-A3 基因转录量3.92 倍(图7)。

图6 提取B16 细胞总RNA 琼脂胶电泳图(琼脂糖凝胶浓度为1.5%)Fig.6 Agar gel electrophoresis figure of total RNA extracted from B16 cells (Agarose gel concentration of 1.5%)

图7 MAGE-A3 基因的荧光定量PCR 检测Fig.7 MAGE-A3 gene of fluorescent quantitative PCR detection

3 讨论

作为癌-睾丸抗原(CT 抗原)家族成员，MAGEA3 有CT 抗原所有的特点［11］，即在正常组织中仅限于睾丸的生殖细胞、胎盘的滋养层细胞中表达。由于睾丸和胎盘是封闭性组织，且不表达HLA-I，不能诱导机体免疫反应。在各种肿瘤组织有不同频率的表达;在胃癌MAGE-A3 阳性率是69.44%、Ⅱ期非小细胞肺癌是49.5%、原发性肝癌是24%、头颈部鳞癌是44.4%、结肠癌是27.3%、肝内胆管癌是40.7%［12］、喉癌MAGE-A3 是51.92%［9］，具有在肿瘤组织中表达广泛、特异的特性，是理想的可用于主动免疫治疗的靶点。

小鼠黑色素瘤B16 细胞最初自发产生于Jackson 实验室C57BL/6 小鼠的耳部皮肤［13］，后发展形成实验动物移植性肿瘤、可在体外生长的传代培养细胞系。由于其基因背景清楚、成瘤率高，C57BL/6小鼠的B16 移植瘤模型在肿瘤研究中较常用［14］。本课题选用小鼠黑色素瘤细胞，保证构建MAGE-A3表达B16 细胞模型能在小鼠体内、体外实验中，均能发挥优势。

绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)分子量较小，易与其他目的基因形成融合蛋白，且不影响自身目的基因产物的空间构象和功能。GFP 与目的基因融合，将目的基因标记为绿色，可定量分析目的基因的表达水平。增强型绿色荧光蛋白EGFP是红偏移的变种的野生型GFP，能发出更明亮的荧光，并优化了在哺乳动物细胞中的表达［15］。

构建的pIRES2-EGFP/MAGE-A3 真核质粒的核糖体进入位点，由pIRES2-EGFP 真核表达载体决定，位于MAGE-A3 与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)编码区之间，这就决定MAGE-A3 和EGFP 基因从单一的双顺反子mRNA 中翻译。因此将MAGE-A3 标记为绿色，可通过EGFP 的表达分析MAGE-A3 的表达水平。由于pIRES2-EGFP 真核表达载体上有新霉素抗性盒，pIRES2-EGFP/MAGE-A3 真核质粒能使抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶高效表达，因此，稳定表达pIRES2-EGFP/MAGE-A3 真核细胞可用氨基糖苷类抗生素G418 筛选，这为筛选稳定表达MAGE-A3 的B16 细胞创造了条件。

外源基因导入真核细胞的方法较多，如重组DNA 病毒感染法、显微注射法、电穿孔法、DEAE-葡聚糖转染法、脂质体转染法和磷酸钙转染法等［16］。脂质体转染法适用于把DNA 转染入悬浮或贴壁培养细胞中，成功率高。

本实验用先期构建的pIRES2-EGFP/MAGE-A3真核表达质粒，其中MAGE-A3 基因来自人喉癌组织，通过脂质体转染法将MAGE-A3 基因导入到小鼠黑色素瘤B16 细胞。转染后24 h 用荧光显微镜观察，绿色荧光蛋白有一定的表达，浓度低，细胞核及细胞胞浆中均可见，以细胞核中表达为主，细胞形态有改变。考虑为:①转染过程中脂质体对细胞壁损伤，细胞壁损伤后，细胞内外渗透压的改变，对细胞活性的影响较大，导致细胞形态改变及活性下降;②细胞生长速度快，细胞密度高，影响细胞伸展、细胞形态;③质粒进入细胞后，一部分到细胞核与细胞DNA 整合，一部分以独立的环状质粒形式参加转录，这表明最初表达绿色荧光的部位在细胞核，同时也说明荧光蛋白在细胞核中能被表达。

蛋白的表达需要时间，由蛋白分子量的大小、细胞生长状态及分裂周期等因素决定，转染后24 h，荧光较弱，也在预料之中。经过G418 筛选约20 d 后，筛选获得的阳性克隆在荧光显微镜下可见明亮的绿色荧光，较刚转染时强，荧光分布均匀，主要位于胞浆、胞核中，细胞培养基中也可见弱荧光，细胞集聚性生长。考虑:①通过G418 药物的筛选，没有成功转入质粒的细胞或转录后表达不稳定的细胞被药物抑制导致凋亡，存活的细胞则能抵抗药物对核糖体干扰，从而不影响荧光及目的基因蛋白质合成;②蛋白质的不断表达，荧光蛋白在细胞内不断蓄积，导致荧光强度的逐渐增强，荧光蛋白或目的基因通过囊泡细胞壁融合或转移的形式排到细胞外，导致细胞培养基中能见到淡淡的荧光;③药物的不断筛选，阳性克隆细胞通过细胞分裂，聚集性生长，因空间的改变，对细胞形态有一定的影响。

因MAGE-A3 和EGFP 基因从单一的双顺反子mRNA 中被翻译，观察荧光蛋白的变化也就能表现MAGE-A3 的变化，荧光蛋白的稳定表达说明MAGE-A3 在B16 细胞中已获得稳定表达且表达产物定位于胞浆、胞核，部分可分泌到细胞培养基中。我们将稳定表达的阳性克隆细胞传代后，提取细胞中的总RNA，反转录为cDNA，以cDNA 为模板，采用荧光定量PCR 技术，检测出MAGE-A3 转录量是空白组的3.92 倍，表明通过脂质体能有效将MAGE-A3 转染到小鼠B16 细胞中并有效地转录，也由于BRAF 突变与RAS 突变均可在PTC 中发生，但这些突变是相互排斥的，表明在PTC 中单一致瘤性事件导致的激酶途径变异足以导致PTC 的发生［9］。另一方面，PTC 可能是由于其他的激酶途径如通过另一个RAS 下游的信号通路，包括AKT/STAT 异常激活导致［10］。那么根据此发病原理，我们设计了KRAS/BRAF 拮抗实验来证实ARMS 方法检出的BRAF 突变的结果。结果证明46 例BRAFV600E点突变均为真阳性。

本研究也存在不足之处，由于BRAF 突变检测至今未确定“金标准”方法，计算直接测序法与ARMS 法的敏感性数据是两种方法互为对照得到的，而在特异性方面，我们定义只要检测到BRAF 突变者即为真阳性，因此两法的特异性均为100%。对甲醛固定的标本是否存在假阳性的问题较难确认，有待于今后深入探究。

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