直接测序法与ARMS 法检测甲状腺乳头状微小癌组织中BRAF 基因突变的比较①

段秀梅 腾永亮 佟玲玲 田 庄 孙 默 王海莹 金美善

(吉林大学白求恩第一医院病理诊断中心，长春 130021)

甲状腺乳头状微小癌(Papillary thyroid microcarcinoma，PTMC)是甲状腺乳头状癌(Papillary thyroid carcinoma，PTC)的一种亚型，占全部甲状腺乳头状癌的50%左右，约有1/3 的病例可发生淋巴结转移，甚至发生远处转移，具有侵袭性发展的特点［1］，因此，对于直径≤1.0 cm 的甲状腺微小病灶的准确判断，为预测临床生物学特征，为临床医生选择合理的治疗方案提供依据。研究发现，PTC 中存在BRAF 基因第15 外显子V600E 高频率的点突变，而在其他的甲状腺良、恶性肿瘤中均未检测到BRAF 基因的突变，这表明BRAF 突变是PTC 特异性的癌基因［2-4］。由于PTMC 病灶小，发病隐匿，大体检查时容易忽略，且在组织学中呈现不典型的病变特征，会导致诊断困难或漏诊，所以，检测BRAF基因的变异对辅助诊断PTMC 很重要，但在检测BRAF 基因突变时发现，采用直接测序法和ARMS方法检测的突变率存在差异。本文旨在探讨直接测序法与ARMS 法检测PTMC 肿瘤组织中BRAF 基因突变的检出率，并比较两种方法检测BRAF 突变的敏感性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本 收集吉林大学第一医院病理科2012～2013 年接受手术治疗的56 例PTMC 标本。男性22 例(39.3%)，女性34 例(60.7%)，年龄33～68 岁，平均48 岁。入选标准:所有患者手术前均未行内、外放射治疗;标本均经常规病理诊断确诊;PTMC 初次切除术后原发灶无癌残留。排除标准:术后复发病例标本;有远处脏器转移病例标本;初次手术后原发灶有癌残留者。

1.1.2 主要试剂 基因组DNA 提取试剂盒QIAamp DNA FFPE Tissue Kit 为德国QIAGEN 产品，聚合酶链反应试剂Premix Ex Taq(Loading dye mix)购自日本TaKaRa 生物技术(大连)有限公司;DNA 凝胶回收试剂盒为美国OMEGA 公司产品。人类BRAF 基因V600E 突变检测试剂盒(荧光PCR法)购自厦门艾德生物医药科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 DNA 提取 中性福尔马林固定的包埋蜡块标本切取5～10 μm 厚的切片5～8 张，同时完成1张常规HE 染色切片，并由病理科医生鉴定肿瘤细胞的存在。DNA 抽提采用QIAamp DNA FFPE 试剂盒，根据说明书提取基因组DNA。洗脱后的DNA经Nano-Drop 核酸蛋白测定仪检测其浓度及纯度。

1.2.2 PCR 法及DNA 测序法检测BRAFV600E基因突变 根据NCBI-GeneBank 中公布的BRAF 基因全序列(NM_007873.2)，确定扩增目的基因片段，应用Primer 5.0 软件，根据引物设计原则设计引物，上游引物:5'-GCTTGCTCTGATAGGAAAATGAG-3';下游引物:5'-GGGCCAAAAATTTAATCAGTGG-3'。利用设计的上、下游引物扩增包含BRAF 基因突变热点(第15外显子1 799 位点)的DNA 片段，PCR 扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳(产物大小为224 bp)，最后将目的片段凝胶回收纯化送至吉林省库美生物科技有限公司进行DNA 测序，并将测序结果与BRAF 基因序列(NM_004333.4)进行比对，以确定有无突变。

1.2.3 ARMS 方法检测BRAFV600E基因突变 加入DNA 模板的量及反应条件均按试剂盒说明书要求，最终反应结果以ADx-BRAF 突变检测试剂盒提供的判读标准确定标本BRAF 基因突变状态。

1.2.4 ARMS 方法检测KRAS/BRAF 拮抗试验 为了避免高敏感性的ARMS 方法检测BRAF 突变导致假阳性结果，本研究设立拮抗实验。对于同1 例病人不可能有KRAS/BRAF 双突变存在。所以KRAS/BRAF 拮抗实验选取ARMS 法检测为BRAF突变阳性的样本46 例，行KRAS 7 个热点突变检测，选1 例结肠癌已知KRAS 突变的样本做实验平行阳性对照，同时行BRAF 突变检测，做实验的阴性对照。实验操作和结果判定均按照说明书要求进行。

1.3 统计学处理 所有统计学检验采用SPSS18.0 统计软件进行数据分析，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两种方法在检测BRAF 突变阳性率的比较 56 例PTMC 标本中，直接测序法检测到BRAF 基因突变18 例，阳性率为32.1%(18/56)，18 例突变均发生第15 外显子1 799 位点突变，即T→A，可导致蛋白质产物中第600 位的缬氨酸(V)被谷氨酸(E)代替(V600E)。见图1。ARMS 法检测到突变46例，阳性率为82.9%(46/56)，后者的突变阳性率明显高于前者(P ＜0.01)。可见，ARMS 法较直接测序法有更高的突变检出率，见图2。

2.2 两种方法检测BRAF 敏感性的比较 56 例PTMC 中，直接测序法灵敏度为39.1 % (18/46)，ARMS 法灵敏度为100%(46/46)，后者显著高于前者(P ＜0.001)。两种检测方法的特异度均为100%。两种检测方法结果不一致者28 例，不一致率为50%，检验符合率为50%。见表1。

2.3 KRAS/BRAF 拮抗实验的结果 在KRAS/BRAF 拮抗实验中，阴性对照和阳性对照都成立的前提下，46 例BRAF 突变阳性的样本中，均无KRAS基因突变;表明BRAF 突变阳性的46 例样本均无假阳性，见图3。

图1 测序法检测PTMC 组织中BRAF 基因第15 外显子序列Fig.1 Results of sequencing BRAF gene in exon 15 in PTMC tissue

图2 ARMS 法检测PTMC 组织中BRAF 基因第15 外显子点突变V600EFig.2 Result of ARMS with BRAFV600E point mutation in exon 15 in PTMC tissue

表1 两种方法检测BRAF 基因突变敏感性的比较Tab.1 Comparison of sensitivity between two detecting methods for BRAF gene mutation

图3 KRAS/BRAF 拮抗实验的结果Fig.3 Result of KRAS/BRAF antagonistic experiment

3 讨论

BRAF 又名鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1，是RAF 基因家族的成员之一，是一种丝氨酸/苏氨酸特异性激酶，调节细胞的生长、发育。这条途径的持续激活将最终导致肿瘤的发生。

BRAF 变异在甲状腺乳头状癌(PTC)中存在很高的发生率，达29%～83%［5］，它是PTC 特异性的遗传突变，与肿瘤的发生、发展有密切关系，PTC 中的BRAF 突变主要是第15 外显子上第1799 位核苷酸上的单碱基转变，即密码子600 的错义突变(V 600E)，导致其编码的氨基酸由缬氨酸转变为谷氨酸。在甲状腺良性结节中并不存在这种突变。所以行BRAF 基因突变检测对于明确甲状腺的良、恶性有一定的指导意义。在治疗方面，由于激活MAPK激酶途径在甲状腺肿瘤的发生和发展中起到很重要的作用，针对MAPK 激酶途径的BRAF 抑制剂可能会成为有效的PTC 治疗药物。在预后方面，BRAF变异与PTC 的腺外侵犯、高分期以及颈部淋巴结高转移率存在一定的相关性［6］，可以帮助临床医生选择最佳的治疗方案。因此，在甲状腺的诊断，治疗以及预后的评估等方面，BRAF 基因突变检测有可能具有很大的临床应有价值。

以往相关研究显示，直接测序法灵敏度有限，检测肿瘤组织的突变含量至少达到20%才能被直接测序法检出［7］，当肿瘤组织中混杂大量正常细胞时其突变信号受抑制，检测效能显著降低［8］。而以荧光定量PCR 技术为基础的ARMS 法，其特异性探针仅识别并扩增BRAF 第15 外显子V600E 突变序列，使得突变信号的收集过程较少受到肿瘤组织中混杂的正常细胞的干扰。因ARMS 法的高选择性及高灵敏性，即使肿瘤组织突变含量低至1%也能被其检出。本次研究结果显示，对于直径≤1.0 cm 的甲状腺微小乳头状癌的病灶标本，直接测序法的BRAFV600E的突变检出率明显低于ARMS 法(32.1% vs 82.9%，P ＜0.01)，而在敏感性方面，直接测序法也比ARMS 法低(39.1% vs 100%，P ＜0.01);ARMS 法检测到BRAF突变而直接测序法未检测到突变的标本共28 例，其中多数的标本是肿瘤细胞比例低于20%的手术标本，这是经HE 染色切片行肿瘤细胞比例评估证实的。可见在进行病灶小的标本检测时，考虑到突变检出率和敏感性等方面，ARMS 法较直接测序法更为可靠。不同灵敏度的方法在检测小病灶标本BRAF 基因突变时，检出率等方面差别显著的主要原因在于病灶小所含肿瘤细胞比例普遍较低。一方面，为提高临床确诊率，常常需要多个病灶切片，来富集肿瘤细胞;另一方面，在进行基因检测前可经过病理评估，将肿瘤区域圈出并人工刮除区域外正常细胞，使得处理后的标本所含肿瘤细胞比例达到90%以上，但对病灶内分散稀少的肿瘤细胞，无法通过上述简单方法去除正常细胞，考虑到直接测序法灵敏度仅为20%，因此，应用灵敏度相对不高的直接测序法进行检测时可导致假阴性结果的增加。另一方面，直接测序法操作繁琐，时间长，且对DNA 的纯度要求较高等方面的缺点，亦不适于大量临床检查。由于BRAF 突变与RAS 突变均可在PTC 中发生，但这些突变是相互排斥的，表明在PTC 中单一致瘤性事件导致的激酶途径变异足以导致PTC 的发生［9］。另一方面，PTC 可能是由于其他的激酶途径如通过另一个RAS 下游的信号通路，包括AKT/STAT 异常激活导致［10］。那么根据此发病原理，我们设计了KRAS/BRAF 拮抗实验来证实ARMS 方法检出的BRAF 突变的结果。结果证明46 例BRAFV600E点突变均为真阳性。

本研究也存在不足之处，由于BRAF 突变检测至今未确定“金标准”方法，计算直接测序法与ARMS 法的敏感性数据是两种方法互为对照得到的，而在特异性方面，我们定义只要检测到BRAF 突变者即为真阳性，因此两法的特异性均为100%。对甲醛固定的标本是否存在假阳性的问题较难确认，有待于今后深入探究。

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