瘦素基因-2548A/G 和瘦素受体基因Gln223Arg 位点多态性与哮喘和代谢综合征的关系①

李云霄 纪 霞 高俊杰 (青岛市市立医院 青岛市常见病重点实验室哮喘病实验室，青岛 266071)

哮喘和代谢综合征均是威胁人类健康的常见病和多发病，近年来哮喘合并代谢综合征的发病也受到关注。瘦素(Leptin，LEP)和瘦素受体(Leptin receptor，LEPR)是肥胖相关的主要因素，LEP 作为一种多效应性细胞因子在大量炎症应答中发挥作用，其功能主要通过LEPR 介导。本研究通过病例对照分析来研究LEP 基因-2548A/G 和LEPR 基因Glu223Arg 位点多态性与哮喘和代谢综合征易感性之间的关系。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 一般资料 选择2012 年3 月～2013 年1 月在青岛市市立医院门诊或住院的哮喘合并代谢综合征病人(A+M)82 例，单纯哮喘病人(AS)114 例，单纯代谢综合征病人(MS)100 例和健康对照(NC)48例，哮喘病人符合《GINA》中的诊断标准，代谢综合征符合2005 国际糖尿病联盟MS 全球共识定义，正常对照组近期无呼吸道及胃肠道感染史，无心、肝或肾病史，一级亲属中无2 型糖尿病、肥胖、高血压、高脂血症及其他代谢性疾病，各组间性别比率及年龄间比较均无差异(P ＞0.05)，一般情况见表1。

1.2 方法

1.2.1 模板DNA 制备 所有入选者过夜禁食12 h，次晨空腹抽取4 ml 外周静脉血EDTA 抗凝，应用美国Promega 公司DNA 提取试剂盒，从PBMC 中提取基因组DNA，定量后-80℃保存备用。

1.2.2 引物合成 根据Genebank 中提供的基因组序列设计PCR 引物，瘦素上游引物序列:5'-TTTCCTGTAATTTTCCCGTGAG-3'，下游引物序列:5'-AAAGCAAAGACAGGCATAAAAA-3'，瘦素受体上游引物序列:5'-ACCCTTTAAGCTGGGTGTCCCAAATAG-3'，下游引物序列:5'-AGCTAGCAAATATTT TTGTAAGCAATT-3'，由上海生工生物技术有限公司合成。

1.2.3 DNA 扩增 PCR 反应体系25 μl，包括模板DNA 100 ng，上下游引物各1 μl，10 × 缓冲液2.5 μl，dNTPs 1 μmol/L，Taq DNA 聚合酶0.75 U，MgCl21.5 μl(25 mmol/L)，加双蒸水至25 μl，试剂均有Fermentas 公司提供。应用Labnet 全自动PCR 扩增仪，反应条件为:94℃预变性3 min，94℃变性45 s，52℃退火45 s，72℃延伸90 s，30 个循环，最后72℃终末延伸8 min。

1.2.4 PCR 产物验证 产物验证取PCR 产物5 μl经2%琼脂糖凝胶电泳后在培清JS-780A 全自动凝胶成像分析仪下观察结果并照相，出现相应条带则证明PCR 成功，可用于以下实验。

1.2.5 限制性核酸内切酶酶切(Restriction fragment length polymorphism，RFLP) 酶切体系共20 μl，包括:LEP 用HhaⅠ(Fast)1 μl，LEPR 用Msp I(Fast)1 μl(内切酶由Fermentas 公司提供)，Fast Buffer 2 μl，PCR 产物17 μl。酶切条件为:37℃，5 min。酶切产物置入3%琼脂糖凝胶(EB 染色)，电压100 V电泳60 min，与Marker(50 bp)对比，使用美国Biorad 凝胶成像系统观察酶切后的产物长度并拍照保存，见图1、2。

1.2.6 基因多态性判断 在瘦素基因5'端启动子区2 548 位核苷酸存在G-A 多态性，当2 548 位为G等位基因时，存在限制性内切酶酶切位点，而当此位为A 等位基因时，无限制性内切酶酶切位点。因此，当瘦素基因型为GG 时，两个等位基因均有切点，酶切产物电泳后有两条带(181、61 bp);当基因型为AA 时，两个等位基因均无酶切位点，酶切产物电泳后为一条带(242 bp);当基因型为AG 时，一个等位基因有酶切位点，另一个等位基因无酶切位点，酶切产物电泳后为三条带(242、181 和6l bp)，因61 bp 很小，在酶切后电泳过程中易丢失。

在瘦素受体基因外显子6 翻译区第668 位核苷酸存在A-G 变异(即Gln223Arg 多态性)，当668 位为A 等位基因时，存在限制性内切酶酶切位点，而当此位为G 等位基因时，无限制性内切酶酶切位点。因此，当瘦素基因型为AA 时，两个等位基因均有切点，酶切产物电泳后有两条带(293、128 bp);当基因型为GG 时，两个等位基因均无酶切位点，酶切产物电泳后为一条带(421 bp);当基因型为AG 时，一个等位基因有酶切位点，另一个等位基因无酶切位点，酶切产物电泳后为三条带(421、293 和128 bp)。

1.3 统计学处理 计算各组瘦素基因-2548A/G、瘦素受体基因Gln223Arg 位点基因型频率及等位基因频率，并确认其是否符合Hardy Weinberg 平衡，各组基因型频率及等位基因频率比较用χ2检验。以上数据应用SPSS17.0 统计软件进行分析，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况比较 各组间性别、年龄比较均无差异(P ＞0.05)，而对于BMI、SBP、DBP、TG、TC、LDLC、FPG、HDL-C，代谢综合征和哮喘合并代谢综合征组与正常对照组和哮喘组相比有显著差异(P 均＜0.05)，见表1。

2.2 遗传平衡检验 对所有研究对象进行Hardy-Weinberg 平衡检验，该位点基因型和等位基因频率符合Hardy-Weinberg 平衡(P ＞0.05)，都来自同一群体。

2.3 瘦素基因-2548A/G 和瘦素受体基因Gln223Arg位点多态性的频率分布 在96 例正常成人中，瘦素基因-2548A/G 的AA 及AG +GG 基因型频率分别为0.625和0.375，A 及G 的等位基因频率分别为0.792 和0.208。瘦素受体基因Gln223Arg 的GG 和AG+AA 基因型频率分别为0.792 和0.208，G 及A 的等位基因频率分别为0.896 和0.104，见表2。

表1 各组临床和实验室指标(±s)Tab.1 Clinical and laboratory parameters of each group(±s)

表1 各组临床和实验室指标(±s)Tab.1 Clinical and laboratory parameters of each group(±s)

Note:M.F.Female;A+M.Asthma-combined Metabolic syndrome;AS.Asthma;MS.Metabolic syndrome;NC.Normal control;BMI.Body mass index;SBP.Systolic blood pressure;1 mmHg=0.133 kPa;DBP.Diastolic blood pressure;TG.Triglyceride;TC.Total cholesterol;HDL-C.High-density lipoprotein-cholesterol;LDL-C.Low-density lipoprotein-cholesterol;FPG.Fast insulin;1):vs CN group，P ＜0.05;2):vs asthma group P ＜0.05.

表2 各组瘦素基因G2548A 和瘦素受体基因Gln223Arg 基因型和等位基因分布频率(%)Tab.2 Frequency distribution of leptin gene promoter region G2548A and LEPR Gln223Arg genotypes and alleles in every groups(%)

表3 各组瘦素-G2548A 和瘦素受体Gln223Arg 基因型及等位基因两两比较Tab.3 Comparison of LEP-G2548A genotype and allele and LEPR Gln223Arg genotype and allele between each group

图1 瘦素基因-G2548A 位点PCR-RFLP 图谱Fig.1 PCR-RFLP patterns of leptin gene -G2548A

图2 瘦素基因Gln223Arg 位点PCR-RFLP 图谱Fig.2 PCR-RFLP patterns of LEPR gene Gln223Arg

2.4 瘦素基因-2548A/G 和瘦素受体基因Gln223Arg 位点多态性与哮喘和代谢综合征的关系

2.4.1 瘦素基因-2548A/G 位点多态性 各组之间瘦素基因-2548A/G 位点基因频率比较见表2。MS和A+M 组AA 基因型频率与NC 相比显著升高(P=0.047 和0.038)，AS 与NC 无差异，其余各组间也无差异。继而对哮喘进行严重程度分组后发现，轻度AS 与NC 无差别，但中重度AS 的AA 基因型频率与NC 相比显著升高(P=0.019 和0.036)，见表2、3。

2.4.2 瘦素受体Gln223Arg 位点多态性 各组之间瘦素受体基因Gln223Arg 位点基因频率比较见表2。MS 的AG+AA 基因型与NC 和AS 相比显著升高(P=0.037 和0)，A+M 的AG+AA 基因型和AS相比有升高趋势(P=0.059)，没有发现AS 与NC间的差异，对AS 严重程度分组后也没有发现与NC的差异，见表2、3。

2.5 瘦素基因-2548A/G 和瘦素受体基因Gln-223Arg 位点等位基因与哮喘和代谢综合征的关系

2.5.1 瘦素基因-2548A/G 位点多态性 MS 和A+M 的A 等位基因频率与NC 相比显著升高(P=0.046 和0.044)，在对哮喘进一步严重程度分组后发现，中重度AS 的A 等位基因频率与NC 相比也升高(P=0.028 和0.041)，见表2、3。

2.5.2 瘦素受体基因Gln223Arg 位点多态性 MS的A 等位基因频率与NC 和AS 相比有显著差异(P=0.023 和0)，A +M 的A 等位基因频率与AS相比也有显著差异(P=0.032)，在对哮喘严重程度分组后未发现与正常组有差异，见表2、3。

3 讨论

瘦素为脂肪组织分泌的激素，通过与瘦素受体(LEPR)结合，发挥抑制食欲、减少热量摄取和脂肪堆积及提高机体代谢率的功能。有学者［1］已经越来越认识到瘦素在代谢疾病中的重要作用，并提出了“瘦素抵抗”学说。瘦素也被认为可以独立预报哮喘的发病和炎症［2］。有报道指出瘦素上调免疫反应，增强CD4+T 细胞、肥大细胞和巨噬细胞的增殖吞噬作用以及单核细胞的增殖［2-7］，不同程度地增加TH1 细胞因子(TNF-α、IL-6、IFN-γ)的产生，减少TH2 细胞因子(IL-5、IL-4、IL-10)的产生，增加气道平滑肌血管内皮生长因子的释放［8］，这些与肥胖或哮喘有关。瘦素受体属于Ⅰ类细胞因子家族，基因位于1 号染色体，由20 个外显子和19 个内含子组成。瘦素与受体结合后，可使受体形成二聚体并磷酸化，通过多种信号途径发挥效应。瘦素受体激活JAK-STAT3 通路、致敏反应细胞激酶、细胞因子信号肽-3 抑制剂(SOCS-3)和COX［9］。人类气道平滑肌细胞表达瘦素受体，瘦素通过调节瘦素受体亚型来抑制血管平滑肌细胞的增长［10］。

3.1 瘦素基因-2548A/G 我们的研究显示，MS 和A+M 的AA 基因型频率显著升高(P=0.047、0.038)，A 等位基因频率升高(P=0.046、0.044)，有研究表明，瘦素基因-2548A/G 多态性与原发性高尿酸血症(HUM)密切相关，A 等位基因可能是HUM 发病的遗传易感因素，冠心病病人-2548 位点A 等位基因的频率高于健康人［10，11］，这与我们的研究结果相似。Szczepankiewicz［12］在哮喘研究中发现，瘦素基因-2548 位点多态性与哮喘相关，哮喘病人AA 基因型和A 等位基因显著高于正常组，GG 基因型是正常者的保护基因。也有研究表明哮喘组瘦素基因-2548 位点A 等位基因频率明显高于健康对照组［13］。虽然我们的研究没有发现哮喘患者瘦素基因-2548 位点AA 基因型或A 等位基因与正常人不同，但在进行哮喘严重程度分组后发现，中重度哮喘AA 基因型和A 等位基因频率比正常组升高(P=0.019 和0.036)，从结果可以推论:瘦素基因-2548 位点多态性可能是代谢综合征的致病因素，也可能与哮喘的严重性相关，参与中重度哮喘发病，这可能是两种疾病存在关系的基因基础，但其具体致病机制还需进一步研究。

3.2 瘦素受体Gln223Arg 1996 年NC sidine等［14］首次报道，LEPR 基 因Gln223Arg 存在变异。LEPR 基因Gln223Arg 变异与肥胖、2 型糖尿病、高血压、血脂紊乱等密切相关，且A 等位基因携带者发生代谢紊乱更加严重，发生MS 的风险更高。Chagnon［15］在魁北克人群中的研究提示GIn223Arg 多态性与体质量指数、皮褶厚度和体内脂肪含量等有关，Guizar-Mendoza 等［16］发现GIn223Arg 位点多态性与心脏交感神经活性、体脂百分比等有关。而Heo［17］未发现瘦素受体基因GIn223Arg 多态性与体质量指数或腰围相关。在我国的研究中，陈海翎［18］等发现携带A 等位基因者发生MS 的风险是G 等位基因的3.302倍。我们的研究发现，MS 比NC 的AG +AA 基因型比例高(P=0.037)，A 等位基因比例也高(P=0.023)，这与之前学者的研究是一致的。Szczepankiewicz［12］的 研 究 中 并 没 有 发 现Gln223Arg位点多态性与哮喘有关，而且至今没有研究证明此基因多态性是否与汉族人哮喘有关。我们的研究也没有发现Gln223Arg 的多态性与哮喘有关，但我们发现:MS 比AS 的AG+AA 基因型频率显著升高(P=0)，A 等位基因也显著升高(P=0)，而A +M 与NC 相比A 等位基因频率没有差异，却与AS 有显著差异(P=0.032)。这提示，A 等位基因可能有对抗哮喘发病的倾向性作用，但却是MS 的致病基因，当AS 合并MS 时，两个相反作用会中和一部分，便没有表现出A+M与NC 的差异，但A 等位基因是否为哮喘的保护基因还需进一步进行研究。这也证明，AS 和MS可能只是两种疾病的共病状态，不存在LEPR 基因方面的共同致病作用，但因为之前没有类似的报道，我们的结果也没有比较。在对哮喘进行分级后也没有发现与LEPR 基因的相关性，说明LEPR 基因对哮喘严重程度并没有作用。

综上所述，我们发现瘦素基因-2548A/G 和瘦素受体基因Gln223Arg 位点多态性均与哮喘和代谢综合征有一定的相关性，瘦素基因-2548 A/G 中A 等位基因可能是代谢综合征的致病基因，而且可能导致严重的哮喘表型;瘦素受体基因Gln223Arg A 等位基因可能是代谢综合征的致病基因，却没有发现其与哮喘的相关性，同时，从这两个基因的角度来看，代谢综合征与哮喘可能是两种疾病的共病状态，之间不存在相对应的致病关系。通过检测基因型，可以筛查哮喘和代谢综合征的易患人群及判断哮喘的严重程度，对及早发现和及时预防有重要意义。

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