脂多糖诱导小鼠腹腔巨噬细胞parkin 表达及线粒体自噬形成①

程艳伟 靳梦醒 闫 海 黄大可 黄保军 张林杰

(安徽医科大学基础医学院免疫学教研室，合肥 230032)

革兰阴性菌感染机体后，巨噬细胞通过其表面膜受体，在其他辅助蛋白的共同作用下识别革兰阴性菌细胞壁成分脂多糖(LPS)，引起一系列炎症因子的释放，诱发多种炎症反应，以限制清除病原菌。然而过度的炎症反应则会造成机体严重伤害［1，2］。

目前认为重度炎症发生时伴随多种组织细胞的线粒体损伤及功能障碍。PRAK2 基因最早在神经系统疾病中发现，其表达产物parkin 是一种E3 泛素蛋白连接酶，在泛素蛋白酶体系统中发挥重要作用。parkin 能选择性的聚集在损伤线粒体上，通过诱导线粒体自噬而清除损伤线粒体［3］。在多巴胺神经元和HEK293 等细胞中，parkin 介导的线粒体自噬对维持细胞的正常功能和细胞生存发挥重要作用［4］。但在巨噬细胞对LPS 刺激的应激反应中，parkin 及其介导的线粒体自噬是否参与对损伤线粒体的清除，目前尚不清楚。本研究拟通过建立小鼠腹腔巨噬细胞内毒素应激模型，观察巨噬细胞在内毒素刺激后parkin 表达分布及线粒体自噬发生情况，为进一步完善炎症反应调控的可能途径提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 昆明种小鼠由安徽医科大学实验动物中心提供;LPS 购自美国Sigma 公司;RPMI1640 培养基购自美国Gibco 公司;胎牛血清购自美国Hyclone 公司;TRIzol 试剂和Mitotracker Green 染料购自美国Invitrogen 公司;mRNA 逆转录试剂盒购自美国Promega 公司;PCR Mix 购自美国MBI Fermentas公司;parkin 单克隆抗体购自美国Santa Cruz 公司;LC3 单克隆抗体购自美国CST 公司;β-actin 单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔和山羊抗小鼠二抗购自北京中杉金桥公司;Alexa Fluor 647 标记山羊抗兔IgG (H+L)和Cy3 标记山羊抗小鼠IgG(H +L)购自上海碧云天公司;特异性引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2 方法

1.2.1 小鼠腹腔巨噬细胞的分离和原代培养 取20～25 g 昆明小鼠，颈椎脱臼处死，无菌分离小鼠腹腔细胞。将混合细胞悬液放入培养箱中，静置2 h，让巨噬细胞贴壁。清除悬浮细胞后，得到腹腔巨噬细胞，然后再加入含10%胎牛血清、1%双抗的1640完全培养基，放入细胞培养箱中培养。待完全培养基培养至少4 h 后，再给细胞以相应处理。

1.2.2 JC-1 法检测线粒体膜电位 将巨噬细胞接种于6 孔板中，每孔加入200 ng/ml LPS 分别作用0、3、6、12、18 h 和24 h，轻轻刮掉细胞，连同上清液一起1 500 r/min，离心10 min，获得细胞。依据JC-1线粒体膜电位检测试剂盒说明，按悬浮细胞方法处理，于流式细胞分析仪上检测线粒体膜电位情况。

1.2.3 RT-PCR 检测小鼠腹腔巨噬细胞parkin mRNA 的表达水平 收集培养皿中200 ng/ml LPS 处理0、3、6、12、18 h 和24 h 后细胞，用TRIZOL 法提取各组巨噬细胞总RNA。先用逆转录试剂盒将总RNA 逆转录成cDNA，再将cDNA 用PCR Mix(2 ×)进行PCR 扩增。GAPDH 引物序列:上游引物5'-CAG TGG CAA AGT GGA GAT TGT TG-3'，下游引物5'-CAG TCT TCT GGG TGG CAG TGA T-3';parkin上游引物5'-CCA CGA TGC TCA ACT TGG CTA C-3'，下游引物5'-CAC GTC AAA CCA GTG ATC TCC C-3'。PCR 产物用1%琼脂凝胶电泳，仪器拍照并用相应分析软件测得各目的条带光密度值(OD)，与内参GAPDH 进行比较，计算OD 比值，分析各时间点目的基因的表达情况。

1.2.4 Western blot 检测parkin、LC3 I 和II 的表达变化 同前收集各组细胞，加入细胞裂解液冰上裂解30 min，再4℃，14 000 r/min 离心30 min，取上清，此为细胞总蛋白。BCA 法蛋白定量后加入上样缓冲液后煮沸5 min。各取30 μg 总蛋白经SDSPAGE 电泳，再转移到硝酸纤维素膜上。然后用5%脱脂奶粉/TBST 室温下封闭2 h，分别用β-actin 抗体(1∶1 000)、parkin 抗体(1∶500)和LC3 抗体(1∶1 000)4℃摇床过夜孵育(12～24 h)。TBST 洗10 min×3 次，再对应加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶10 000)室温孵育1～2 h，TBST 洗10 min ×5次。用ECL 试剂盒进行显影曝光。采用凝胶分析软件测得各蛋白条带光密度值(OD)，并与内参βactin 进行比较，计算出OD 比值，分析各组各时间点目的蛋白表达情况。

1.2.5 细胞免疫荧光法检测parkin 在巨噬细胞中分布 将小鼠腹腔巨噬细胞加入预先放有无菌盖玻片的24 孔板中，去除悬浮细胞培养4 h，制备细胞爬片。加入200 ng/ml LPS 作用6 h，取出细胞爬片，4%多聚甲醛室温固定20 min，PBS 洗3 ×5 min，0.3% Triton X-100 室温作用10 min 进行细胞膜通透，PBS 清洗，10%小牛血清37℃封闭1 h，1∶100 稀释的parkin 抗体4℃冰箱孵育24 h，PBS 洗3 ×5 min，FITC 标记的山羊抗小鼠二抗37℃避光孵育1 h，PBS 洗5 ×5 min，用激光共聚焦显微镜观察拍照。

1.2.6 细胞免疫荧光法检测parkin、LC3 和线粒体三者共定位 同前述方法制备细胞爬片，处理细胞。孵育一抗时，同时加入parkin 抗体(1∶100 稀释)和LC3 抗体(1∶100 稀释)，4℃冰箱孵育24 h，PBS 洗3 ×5 min，再同时加入parkin 二抗(Cy3 标记山羊抗小鼠IgG，1∶100 稀释)和LC3 二抗(Alexa Fluor 647标记山羊抗兔IgG，1∶100 稀释)，37℃避光孵育1 h，PBS 洗5 × 5 min，最后用MitoTracker Green(100 nmol/L)标记线粒体，室温30 min，PBS 洗5 ×5 min。用激光共聚焦显微镜观察拍照。

1.3 统计学处理 用IBM SPSS Statistics 19 统计软件包对数据进行分析。实验数据采用±s 表示，各时间点间数据比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 巨噬细胞经LPS 刺激后，线粒体膜电位呈下降趋势 JC-1 是线粒体的一种特异性染料，在线粒体膜电位正常时为聚合物(J-aggregates)，呈橘红色，若线粒体发生损伤，膜电位下降后，JC-1 则变成单体(monomer)，呈绿色，流式细胞仪检测线粒体红光和绿光比例可检测线粒体损伤情况。巨噬细胞在经LPS(200 ng/ml)刺激0、3、6、12、18 h 和24 h 后，流式细胞仪检测结果如图1 所示:巨噬细胞线粒体膜电位随LPS 作用时间延长呈持续下降趋势，膜电位下降的线粒体与正常线粒体的比例由刺激前的4.02%±0.18%增加到刺激24 h 后的25.43%±0.37%，表明巨噬细胞经LPS 刺激后存在线粒体损伤，且随作用时间延长损伤加剧。

2.2 parkin 在巨噬细胞经LPS 刺激前后的表达变化 为了解parkin 在巨噬细胞中的表达情况，应用200 ng/ml LPS 分别作用小鼠腹腔巨噬细胞0、6、12 h 和24 h，通过RT-PCR 和Western blot 分别检测parkinmRNA和蛋白表达水平。结果显示:巨噬细胞在LPS 刺激后，parkin 在蛋白水平表达明显增多，至刺激后12 h 达到最高峰(图2);parkin mRNA 表达水平增加不明显(结果未显示)。

图1 LPS(200 ng/ml)作用巨噬细胞后线粒体膜电位变化情况Fig.1 Changes in mitochondrial membrane potential of murine peritoneal macrophages induced by LPS(200 ng/ml)

2.3 LPS 刺激前后，parkin 在巨噬细胞内的定位情况 小鼠腹腔巨噬细胞在200 ng/ml LPS 刺激6 h后，利用细胞免疫荧光法标记parkin，DAPI 染细胞核，通过激光共聚焦显微镜检测parkin 在巨噬细胞中的分布情况。结果显示:巨噬细胞在未受刺激状态下，parkin 均匀分布在细胞质中，在LPS 刺激后parkin 形成聚集体，呈斑点状聚集分布在细胞中(图3)。

2.4 小鼠腹腔巨噬细胞在LPS 刺激后LC3 的表达水平 自噬体形成时，胞浆LC3 的羧基端会被酶解掉一小段多肽产生LC3 Ⅰ，LC3 Ⅰ羧基端的甘氨酸与磷脂酰乙醇胺(PE)结合产生LC3 Ⅱ，被招募并定位在自噬体膜的内外表面。通过Western blot 检测LC3 Ⅱ的蛋白水平以及LC3 Ⅱ和LC3 Ⅰ比值大小可评估自噬发生的程度。用200 ng/ml LPS 分别作用小鼠腹腔巨噬细胞0、6、12 h 和24 h，Western blot检测LC3 Ⅰ和Ⅱ的表达水平，结果显示:在LPS 刺激后，巨噬细胞LC3 Ⅱ的表达随刺激时间延长逐渐增多，LC3 Ⅱ/Ⅰ比值也增大，表明LPS 导致巨噬细胞发生自噬(图4)。

图2 LPS(200 ng/ml)作用小鼠腹腔巨噬细胞后parkin表达水平Fig.2 Expression of parkin protein in murine peritoneal macrophages induced by LPS (200 ng/ml)

图3 parkin 在巨噬细胞中的分布情况Fig.3 Distribution of parkin in murine peritoneal macrophages

图4 LPS(200 ng/ml)作用小鼠腹腔巨噬细胞后LC3 Ⅱ与LC3 Ⅰ蛋白比例变化情况Fig.4 Expressions of LC3 Ⅱand LC3 Ⅰprotein in murine peritoneal macrophages induced by LPS (200 ng/ml)

图5 Parkin、线粒体和自噬体三者在细胞中存在共定位情况，LPS(200 ng/ml)作用巨噬细胞6 hFig.5 Co-localization of parkin，mitochondria and LC3 in murine peritoneal macrophages when stimulated with LPS(200 ng/ml)after 6 h

2.5 LPS 刺激后，巨噬细胞内parkin、LC3 和线粒体存在共定位关系 LPS 刺激巨噬细胞后，存在线粒体损伤、细胞自噬，同时parkin 由均匀分布转成向明显的斑点状聚集。为探讨三者之间可能存在的相互作用，在200 ng/ml LPS 作用巨噬细胞6 h 后，分别用三种不同荧光染料标记parkin、线粒体和LC3，通过激光共聚焦显微镜检测三者的共定位情况，结果显示:LPS 刺激后，巨噬细胞内parkin、线粒体和LC3存在共定位，表明parkin 介导的线粒体自噬形成(图5)。

3 讨论

病原微生物入侵机体后，巨噬细胞借助其表面模式识别受体、Fc 受体和补体受体等首当其冲对病原微生物做出快速反应，是参与固有免疫应答的重要效应细胞。巨噬细胞通过分泌多种酶类、细胞因子和反应性氧中间物等参与炎症反应的发生和发展。巨噬细胞释放的多种生物活性物质可以限制病原体的侵害，但过度的炎症反应也可造成机体损伤。

线粒体在调控细胞凋亡、能量代谢方面起着重要作用，在机体受到病原微生物感染时，由于缺血、缺氧和过度炎症应答常导致多种组织细胞线粒体功能改变及线粒体膜电位的降低［5］。线粒体膜电位降低可促进mtROS 产生及线粒体DNA 释放到胞质，从而诱导NLRP3 炎症小体的活化［6，7］。同时，NLRP3 炎症体活化又促进mtDNA 的释放，致使线粒体进一步损伤。受损线粒体需要及时清除，以保证细胞正常生命活动的进行［8］。线粒体自噬就是将多余或损伤线粒体与溶酶体结合进行自噬选择性清除的过程［9］。

本研究首先应用脂多糖作用于小鼠腹腔巨噬细胞，发现脂多糖可导致巨噬细胞线粒体膜电位降低，表明线粒体在巨噬细胞对内毒素应答中起到一定作用，这与Arnoult 等［10］研究结果相一致。巨噬细胞在对内毒素应答中会导致线粒体损伤，如不能及时清除损伤线粒体，可能会进一步加重炎症反应。Parkin 及其介导的线粒体自噬在对损伤或多余线粒体的选择性清除过程中发挥重要作用［11］。Narendra等［3］研究显示，HEK293 和Hela 细胞在加入CCCP引起线粒体损伤后，parkin 能够被选择性募集至线粒体膜电位降低的线粒体，而使胞质中parkin 降解减少，parkin 在细胞中表达相对增多，并通过E3 泛素连接酶活性介导这些损伤的线粒体经自噬体途径清除，以减少对细胞的损伤。本研究利用RT-PCR和Western blot 的方法检测了parkin 在小鼠腹腔巨噬细胞内毒素应激中的表达变化，结果显示parkin在mRNA 水平变化不明显，但在蛋白水平表达明显增多，表明parkin 在胞质中降解减少，提示parkin 可能通过蛋白水平的变化发挥相应的作用。对parkin在巨噬细胞受到脂多糖刺激前后分布的研究表明，巨噬细胞在未受刺激状态下parkin 在胞质中均匀分布，而脂多糖刺激后则转变成明显的点状聚集;同时对自噬相关蛋白LC3 Ⅱ及LC3 Ⅰ表达变化的检测发现，巨噬细胞在受到LPS 刺激后发生明显的自噬，与张梅等［12］在巨噬细胞系RAW264.7 中的研究结果一致。进一步对parkin、LC3 及线粒体共定位分析的结果显示，parkin 参与了巨噬细胞对清除损伤线粒体的线粒体自噬发生，表明其可能在巨噬细胞参与的炎症反应中起到一定的调控作用。

本研究深入探讨了小鼠腹腔巨噬细胞在内毒素刺激下parkin 的表达变化及其介导的线粒体自噬形成，提示parkin 可能通过介导线粒体自噬方式参与巨噬细胞对内毒素应激所致炎症反应的调控作用。为进一步明确parkin 在巨噬细胞炎症反应中的作用及机制，更深入的实验可通过基因转染及RNA 干扰技术调控parkin 的表达，并观察其对内毒素诱导巨噬细胞炎症因子释放的影响，为完善炎症反应调控的可能途径提供新的思路。

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