肌糖蛋白TN－C促进人骨髓基质干细胞向成骨细胞的分化

曹玉净，吕秋霞

(河南省中医院创伤骨科，河南郑州450002

骨折愈合是一个极其复杂的修复过程，受诸多因素的影响，包括全身性因素和局部性因素。怎样早期促进骨折愈合，一直是骨伤科领域的重点课题之一。在骨折愈合的过程中，骨折部位的血液供应、感染的影响、软组织损伤程度、骨折端软组织嵌入等都会影响愈合过程［1］。

肌糖蛋白C(tenascin－c，TN－C)，又被称为神经胶质/间叶细胞细胞外基质蛋白(GMEM)或肌腱抗原，是由分子质量在190～300 ku 的亚基通过二硫键连接的寡聚物。与其他的细胞外基质蛋白如纤连蛋白(fibronectin)和层粘连蛋白(laminin)相比，TN－C 的表达通常是瞬时的，并且高度控制在胚胎发育阶段。但在正常或病理的组织重塑时，成体器官的特定组织重新表达TN－C。在组织损伤中，TN－C介导炎性反应和纤维化进程，促进组织的再生修复［2］。近10年的研究发现:TN－C 在心肌和动脉损伤，肿瘤血管再生和肿瘤转移，以及调节干细胞的行为中有至关重要的作用［3，4］。但对于TN－C 是否能诱导骨再生尚缺乏相关的研究。本研究旨在探讨TN－C 对骨再生的影响及潜在的机制，为TN－C 在促进骨折愈合中的应用提供可参考的价值。

1 材料与方法

1.1 材料

DMEM 培养基(Gibco 公司);胎牛血清(FBS)(杭州四季青生物科技公司);0.25%胰蛋白酶、青霉素和链霉素(Hyclone 公司);碱性磷酸酶试剂盒(碧云天公司);BCA 蛋白定量试剂盒(Pierce 公司);骨钙素放免试剂盒(Immutopics 公司);24 孔细胞培养板和96 孔细胞培养板板(上海生工生物科技有限公司);细胞茜素红(上海杰美基因医药科技公司);cDNA 合成试剂盒、DMSO 和MTT(大连宝生物);鼠抗人TN－C 一抗及羊抗鼠二抗(Sigma 公司);RNAprep 总RNA 提取试剂盒和ECL 发光试剂盒(北京天根生物科技公司);重组人PDE1B(北京义翘神州生物技术有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 人骨髓基质干细胞的分离培养与处理:所有材料的获取按照标准流程在本实验室高级实验员的监督下完成。本研究得到河南省中医院伦理委员会的同意。骨髓由2013年1月至6月于河南省中医院住院患者志愿捐献，所有患者均签订知情同意书。采用全骨髓培养法，多次消化以纯化人骨髓基质干细胞(hBMSCs)。分离纯化的hBMSCs 培养在含有10% FBS，100 μg/mL 青霉素和100 μg/mL 链霉素的DMEM 培养基中，于37 ℃恒温CO2培养箱中培养［5］。

1.2.2 重组TN－C 的制备:已有研究表明，骨肉瘤细胞MG－63 中TN－C 高表达［6］。因此本研究使用RNAiso 从人骨肉瘤细胞MG－63 中提取总RNA 并进行反转录获取TN－C cDNA。以2 μL TN－C cDNA 作为模板，使用特异性引物进行PCR 扩增TN－C。获得的TN－C DNA 纯化后插入pCDNA3.1(+)载体，并转染目的细胞人胚肾HEK293A 进行TN－C 的体外表达。重组表达的TN－C 经镍柱亲和层析纯化并进行Western blot 检测其表达。

1.2.3 Western blot 检测蛋白表达:上述制备纯化的rTN－C 经BCA 蛋白定量试剂盒测蛋白的浓度。取蛋白样品30 μg，进行SDS－PAGE 电泳。电泳结束后，通过电转移将凝胶上的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。然后，将膜置于10 mL 现配的封闭液中2%脱脂奶粉，TBS(Tris－buffered saline，150 mmol/L NaCl，10 mmol/L Tris－HCl，pH 7.5)封闭1 h;依次加入鼠抗人TN－C 一抗(1∶1 000 稀释)，4 ℃过夜孵育;TBST(TBS 含0.02% Tween)洗3 次，加入HRP偶联的羊抗鼠二抗(1∶10 000 稀释)室温孵育2 h;TBST 洗膜3 次，TBS 洗膜1 次。使用ECL 发光试剂盒检测TN－C 的表达。

1.2.4 MTT 法检测细胞增殖能力:取生长良好的hBMSCs 细胞制备细胞悬浮液，计数后以2 ×104个/孔接种于96 孔板，每孔200 μL。待细胞贴壁后，更换含有不同浓度重组TN－C 蛋白的条件培养基并继续培养。12 h 后，向每孔加入5 g/L 的MTT 储存液20 μL，继续培养4 h;弃上清后，加入150 μL 二甲基亚砜(DMSO)，置于低温摇床低速振荡10 min，使结晶物充分溶解，并于酶标仪上测定490 nm 处吸光度值(A)。

1.2.5 细胞茜素红染色:原代培养8～11 d 后细胞汇合成单层，按1 ∶ 3 的比例传代，细胞计数后以3 ×105个/孔接种到24 孔培养板中。待细胞汇合度基本达到50%，分别对细胞进行如下处理:实验组采用含有不同浓度重组TN－C(rTN－C)蛋白的条件培养液(0、1、10、50 和100 nmol/L)处理不同的时间，对照组采用不含TN－C 蛋白的完全培养液。不同处理的细胞培养一定的时间后，用细胞茜素红对细胞进行染色，检测hBMSCs 向成骨细胞的分化。

1.2.6 RT－qPCR 检测ALP 和OCN mRNA 的表达:收集实验组或对照组细胞，按照RNAprep 培养细胞总RNA 提取试剂盒说明书提取细胞总RNA，按照PrimeScript RT reagent Kit(Perfect Real Time)试剂盒说明书进行反转录获得cDNA。以获得的cDNA 为模板进行实时定量PCR，检测ALP 和OCN 的mRNA水平变化，并以β－actin 作为内参。本实验所使用的特异性引物序列如下:ALP:正义链:5'－GCACCATG ATTTCACCAT－3';反义链:5'－CTGGGCCCTCAGAAC AGGAC－3';OCN:正义链:5'－CGAGACACCATGAGA GCC－3';反义链:5'－GAGCGACACCCTAGACCG－3';β－actin:正义链:5'－CAACTTGATGTATGAAGGCTTT GGT－3';反义链:5'－ACTTTTATTGGTCTCAAGTCAGT GTACAG－3'。所有引物合成均由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

1.2.7 ALP 比活性的测定:传代的hBMSCs 细胞用含有不同浓度TN－C 重组蛋白的条件培养基以5 ×104/cm2接种于6 孔板中，在TN－C 重组蛋白作用的第3、6 和12 d 收集并裂解细胞，按照ALP 试剂盒说明书操作，并用BCA 蛋白定量试剂盒定量总蛋白。计算细胞内ALP 比活性，单位为U/L。

1.2.8 OCN 含量的检测:传代的hBMSCs 细胞用含有不同浓度rTN－C 的条件培养基以5 ×104/cm2接种于6 孔板中，在rTN－C 作用后按预计时间收集各组细胞，按骨钙素放免试剂盒说明书检测OCN含量。

1.3 统计学分析

采用SPSS 12.0 统计软件对数据进行t 检验，并用Graphpad prism 5.0 作图。结果用均数±标准差(±s)表示。

2 结果

2.1 重组TN-C 蛋白的检测

鼠抗人TN－C 抗体能与重组TN－C 蛋白免疫，显示单一的条带，而对照组蛋白(本实验采用含有GST标签的重组人PDE1B)蛋白未能显示条带(图1)。

2.2 rTN-C 促进hBMSCs 向成骨细胞分化

不同浓度的rTN－C(0、1、10、50 和100 nmol/L)处理hBMSCs 24 h 后，细胞数量无明显上升(图2A)。在rTN－C 处理细胞的第10 天，rTN－C 剂量依赖性促进成骨细胞的矿化(图2B)。

图1 Western blot 检测制备的TN-C 重组蛋白Fig 1 Detection of recombinant TN-C by Western blot

图2 rTN-C 对hBMSCs 增殖及矿化的影响Fig 2 The effect of rTN-C on the proliferation and mineralization of hBMSCs

2.3 rTN-C 对ALP 水平及比活性的影响

不同浓度rTN－C 处理hBMSCs 10 d 后ALP mRNA水平随rTN－C 浓度显著上升(P＜0.05)。但在rTN－C ＞50 nmol/L 后，ALP mRNA 水平与50 nmol/L组相比没有显著性变化(图3 A)。

50 nmol/L rTN－C 处理hBMSCs 不同时间(3、6、9 和12 d)后，细胞内ALP 的比活性明显高于对照组(表1)，并随诱导时间的延长而继续显著增高(P＜0.05)。

2.4 rTN-C 对OCN 的影响

与ALP 类似，与对照组相比不同浓度rTN－C 处理hBMSCs 10 d 后，OCN mRNA 水平随rTN－C 浓度

显著上升。但rTN－C ＞50 nmol/L 时，OCN mRNA 水平与50 nmol/L 组相比没有显著性变化(图3B)。50 nmol/L rTN－C 处理hBMSCs 后，OCN 含量随着处理时间的延长而增加，从处理后第12 d 起实验组OCN 含量显著高于对照组(P＜0.05)(表2)。

3 讨论

TN－C 是细胞外基质重要成分，最早发现其能调节细胞与纤连素之间的黏附，能被分类为抗黏附和黏附调节蛋白。TN－C 在发育阶段和成人中都能调节表达。组织学中观察到TN－C 在器官形成中短暂表达，而在已经完全发育成熟的器官中则丰度降低或者不表达。但是在一些病理情况下如感染，炎症和肿瘤情况下表达升高。研究表明TN－C 在调节细胞黏附、迁移和生长，影响肿瘤生长、侵袭、血管形成以及免疫抑制中有重要作用，另外TN－C 还参与炎症反应与组织重塑。骨折愈合过程是一个复杂而连续的过程，主要包括几个阶段:血肿炎症机化期、原始骨痂形成期、骨板形成塑形期。患者的年龄、健康状况、骨折的类型和数量、骨折部位的血液供应、软组织的损伤程度、软组织的嵌入和感染等都是影响骨折愈合的重要因素。

鉴于TN－C 在组织重塑、血管再生和炎症中的重要作用，本研究对TN－C 在骨折愈合中的潜在作用进行了初步的研究，发现rTN－C 能促进骨髓基质干细胞向成骨细胞分化，表现为增加骨基质干细胞碱性磷酸酶含量和骨钙素含量。

图3 实时定量PCR 检测rT-C 处理细胞对细胞内ALP 和OCN mRNA 水平变化的影响Fig 3 RT-PCR were employed to detect the mRNA level of ALP and OCN in cells treated with rT-C

表1 rTN-C 处理的实验组与对照组细胞ALP 活性测定Table 1 The activity of ALP in control group and experimental group treated with rTN-C(±s，U/L，n=3)

表1 rTN-C 处理的实验组与对照组细胞ALP 活性测定Table 1 The activity of ALP in control group and experimental group treated with rTN-C(±s，U/L，n=3)

＊P＜0.05 compared with control.

group culture time 3 days6 days9 days12 days control0.179 ±0.0250.210 ±0.0350.224 ±0.043 0.260 ±0.091 experimental0.362 ±0.033*0.561 ±0.022*0.570 ±0.018*0.705 ±0.113*

表2 不同时间OCN 含量的变化Table 2 The content of OCN in cells treated for different time (±s，ng/mL，n=3)

表2 不同时间OCN 含量的变化Table 2 The content of OCN in cells treated for different time (±s，ng/mL，n=3)

＊P＜0.05 compared with control.

group culture time 3 days9 days12 days18 days control0.321 ±0.0640.476 ±0.0610.601 ±0.052 0.790 ±0.091 experimental0.410 ±0.0390.590 ±0.0760.677 ±0.064*0.875 ±0.077*

ALP 是成骨细胞矿化过程中主要的功能活性酶，测定成骨细胞内ALP 活性变化可反应成骨细胞的分化成熟程度和细胞成骨矿化的能力，因此其常作为成骨细胞分化和功能成熟的早期标志分子。ALP 主要存在于胞质中，分解有机质中磷酸，增加局部无机磷酸浓度，促进矿化，在成骨细胞趋向成熟的转化限制点扮演重要角色。本研究中发现，重组TN－C 蛋白处理人骨髓基质干细胞一定时间后，ALP 活性较未做任何处理的对照组显著上升。

OCN 在维持正常骨钙化率和抑制软骨钙化中有重要作用，也常用作成骨细胞分化成熟的标志。本实验结果显示:在重组TN－C 处理细胞后的第12天开始，实验组OCN 含量与未做处理的对照组相比差异升高。重组TN－C 对ALP 和OCN 的活性的影响说明其对hBMCs 分化有促进作用。结合重组TN－C 在组织重塑及血管再生中的重要作用，TN－C可能在骨折愈合中有促进血管再生和促进成骨细胞成熟的双重作用。

［1］秦煜.骨折愈合，延迟愈合和骨不连［J］.中华创伤骨科杂志，2004，6:1059－1062.

［2］Saika S，Sumioka T，Okada Y.Wakayama symposium:modulation of wound healing response in the corneal stroma by osteopontin and tenascin－C［J］.Ocular Surface.2013，11:12－15.

［3］Orend G.，Chiquet－Ehrismann R.Tenascin－C induced signaling in cancer［J］，Cancer letters，2006，244:143－163.

［4］Imanaka－Yoshida K.Tenascin－C in cardiovascular tissue remodeling:from development to inflammation and repair［J］.Circ J，2012，76:2513－20.

［5］王忠，高毅，汪艳，等.人骨髓间充质干细胞分离培养与鉴定［J］.中华神经医学杂志，2006，10:973－976.

［6］Zheng L，Zhang D，Zhang Y，et al.mTOR Signal Transduction Pathways Contribute to TN－C FNIII A1 Overexpression by Mechanical Stress in Osteosarcoma Cells［J］.Mol Cell，2014，37:118－125.