SASH1通过MAP2K2和MAP4K4与ERK信号通路交互作用

王 晶，贺 勇，张继旺，廖 娟，曾家伟，周定安*

(重庆医科大学附属永川医院1.检验科;2.中心实验室，重庆402160;3.都江堰市人民医院检验科，都江堰611830)

SAM and SH3 domain containing 1(SASH1)基因是一种新的候选抑癌基因，在多种组织中表达，其表达减少与肿瘤的生长、入侵、转移和预后不良密切相关。但其在肿瘤形成、增殖和转移中的作用机制并不清楚。

细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase，ERK)信号传导途径是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases，MAPK)信号通路中最重要的途径之一，不仅可以调节细胞生长、分裂、增殖和迁移等多种生理功能，在细胞恶性转化等病理过程中也起重要作用［1］。MAP4K4 是MAPK 信号系统的上游激酶，在细胞系中能够调节ERK 活性的一种丝/苏氨酸的蛋白激酶［2］。还有研究表明，MAP4K4 可激活MEK 和MEKK［3］。因此，本研究拟探讨SASH1 与ERK 信号通路的两个关键分子MAP2K2(mitogen activated protein kinase kinase 2)和MAP4K4 之间是否存在相互作用关系，为深一步研究SASH1 是否通过ERK 信号通路调节肿瘤细胞的增殖、转移和凋亡等细胞功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和载体:大肠杆菌E.coli Top 10(康为世纪生物有限公司)，pBABE-Flag-puro 反转录病毒、野生型 SASH1-Pegfp-C3 质粒、MDA-MB-231 和HEK-293T 细胞(重庆医科大学附属永川医院中心实验室保存)。

1.1.2 试剂:限制性内切酶(Hind Ⅱ、KpnⅠ、XhoⅠ和HpaⅠ)和DNA T4 连接酶(TaKaRa 公司)、哺乳动物蛋白抽提试剂LY006、SBP-beads(GE 公司)、Phusion Hot Start High Fidelity Polymerase (New England Biolabs 公司)。si-RNA 设计合成(上海吉玛有限公司完成)，引物合成和测序(上海英骏生物公司广州分公司完成)。

1.2 方法

1.2.1 SBP-Flag-SASH1-pBABE-puro 重组质粒的构建:对SBP-Flag-pBABE-puro 反转录病毒质粒多克隆位点区进行改造，合成一对含有EcoR Ⅰ、SalⅠ、XhoⅠ和HpaⅠ酶切位点的互补引物，序列如下:5'-AATTCCCGCTCGAGCGGGTTAACATGG-3' (正 义链)，5'-TCGACCATGTTAACCCGCTCGAGCGGG-3'(反义链)。将该互补序列连接到SBP-Flag-pBABEpuro 反转录病毒质粒，使其含有XhoⅠ和HpaⅠ酶切位点序列。用XhoⅠ和HpaⅠ从SASH1-Pegfp-C3质粒上切下SASH1 基因并插入SBP-Flag-pBABEpuro 反转录病毒质粒，通过菌落PCR 和测序鉴定SBP-Flag-SASH1-pBABE-puro 重组质粒。

1.2.2 建立稳定表达外源性SASH1 基因的HEK-293T 细胞:将重组质粒转化至Top 10 感受态细胞中，提取重组质粒后用Lipofectamine2000 转染至HEK-293T 细胞，48 h 后加入2 ×10－3g/L 嘌呤霉素筛选细胞系，大量培养稳定表达外源性SASH1 基因的细胞系(稳定表达SASH1 基因的293T 细胞系简称SASH1-293T 细胞)。

1.2.3 Western blot 鉴定重组质粒的表达:用蛋白抽提试剂LY006 提取SASH1-293T 稳转细胞蛋白，蛋白定量后加入上样缓冲液，95 ℃煮沸使蛋白充分变性。聚丙烯酰胺凝胶电泳后转至PVDF 膜，脱脂奶粉封闭，加PBS 稀释的抗Flag 抗体(1∶400)。孵育过夜，TBST 洗膜后加羊抗鼠IgG(H +L)二抗，室温孵育1 h，TBST 洗膜后显色。

1.2.4 SBP-pull down 实验:待SASH1-293T 细胞长满约90%时，用裂解液裂解15 min，将裂解产物在4 ℃，12 000 r/min，离心15 min，收集上清。在裂解的蛋白质样品中加入60 μL SBP-beads(GE 公司)，4 ℃低速旋转结合4 h 后3 000 r/min，低温离心5 min，吸去上清。PBS 洗涤3 遍后留约1 mL 含沉淀复合物的悬液转至1.5 mL 低蛋白亲和离心管(eppendprf 公司的Protein LoBind Tube)中，一部分做Western blot 检测Flag-SASH1 的表达情况，另一部分加50 mmol/L NH4HCO3，4 ℃，3 000 r/min 离心1 min，重复两次，去掉上清。再加入200 μL 50 mmol/L NH4HCO3，用测序级胰蛋白酶在37 ℃旋转仪上酶切过夜后，收集上清继续用胰蛋白酶酶切8 h，取出两次酶切蛋白生成的多肽，99 ℃灭活胰蛋白酶5 min，－20 ℃冻干，送复旦大学生物医学研究院系统生物研究所做LC-MS/MS 串联质谱分析。

1.2.5 Nano-flow LC-MS/MS 质谱分析:用两台LC-20AD 和一台LC-20AB 色谱泵，一台SIL-20AC 自动进样器，样品以20 μL/min 的速度注入loop 环中，使ACN 在120 min 内由0%线性增加至45%，用LTQ-Orbitrap 线性离子阱-轨道离子阱质谱仪以Orbitrap轨道离子阱(在400～2 000 的质荷比范围内以60 000 的分辨率)采集一级质谱图，用LTQ 线性离子阱将以上采集得到的质谱图中强度最高的10 个信号进行串联质谱实验。质谱条件为:纳升级电喷雾电离方式(nano-ESI)，正离子模式扫描，电离电压1 900 V，离子入口管温度180 ℃，扫描质荷比范围为400～2 000。质谱数据由Xcalibur 软件采集并处理。处理后的数据用Bioworks 软件根据Sequest 算法在SWISSPROT HOMO SAPIENS 数据库及其对应的反序列符合数据库进行搜索。利用蛋白质专业数据库(http://www.uniprot.org/uniprot)和KEGG pathway 信号通路研究数据库(http://www.genome.p/dbget-bin/show _ pathway?hsa04916 +5605)分析可能与SASH1 结合的并参与ERK 信号通路调节的分子。

1.2.6 免疫沉淀检测SASH1 与MAP2K2 和MAP4K4的相互作用:为进一步鉴定SASH1 与MAP2K2 和MAP4K4 是否存在相互作用，用pEGFP-C3 质粒和SASH1-pEGFP-C3 质粒共转染HEK-293T 细胞，然后提取蛋白进行免疫沉淀实验。具体步骤:将细胞用冰的PBS 洗涤1 遍后蛋白裂解液裂解10 min。将裂解物在4 ℃，5 000 r/min，离心10 min，取上清。加入琼脂糖蛋白A/G 后4 ℃旋转混匀45 min，4 ℃，5 000 r/min 离心5 min，取上清。再加入GFP-Tag(Abmart 公司)，4 ℃旋转混匀过夜后加20 μL proteinA/G Agarose，继续4 ℃旋转混匀4 h。PBS 洗涤4 次，免疫沉淀物加上样缓冲液煮沸变性、SDSPAGE 电泳、转膜、封闭、分别加抗GFP-SASH1、MAP2K2、MAP4K4 一抗4℃孵育过夜，洗膜后加入抗兔/鼠IgG，检测其是否存在相互作用。

1.2.7 siRNA 细胞系的建立及检测:将SASH1-siRNA 转染至MDA-MB-231 细胞系，以空白组和Negativ-siRNA 组为对照。siRNA 序列分别为:siRNA-1:5'-GCACGUUCAAGUUCAUCUATT-3'(正义链)，5'-UAGAUGAACUUGAACGUGCTT-3'(反义链);siRNA-2:5'-GACUCAGGAUGCUACGAAATT-3' (正义链)5'-UUUCGUAGCAUCCUGAGUCTT-3'(反义链);阴性对照组(NC):5'-UUCUCCGAACGUGUCACG UTT-3'(正义链)，5'-ACGUGACACGUUCGGAGAA TT-3'(反义链)。72 h 后用蛋白抽提试剂LY006 提取细胞蛋白，Western blot 检测SASH1 和P-ERK1/2蛋白的表达情况。

2 结果

2.1 成功构建SBP-Flag-SASH1-pBABE-puro 重组质粒

扩增产物与预期片段大小相符(图1)。测序结果无杂峰和套峰，碱基无突变。SBP-Flag-SASH1-pBABE-puro 重组质粒中SASH1 与NCBI 公布的序列完全一致。因此SBP-Flag-SASH1-pBABE-puro 重组质粒构建成功。

图1 SASH1 基因PCR 鉴定结果Fig 1 PCR identification result for SASH1 gene

2.2 Flag-SASH1 融合蛋白在HEK-293T 细胞稳定表达

SBP-Flag-SASH1-pBABE-puro 重组质粒组细胞在180 ku 附近表达Flag-SASH1 融合蛋白条带，而空载质粒无Flag-SASH1 融合蛋白表达(图2)。

图2 Flag-SASH1 融合蛋白的鉴定Fig 2 Identification of Flag-SASH1 recombinant protein

2.3 SBP-pull down 实验和Western blot 实验获得SASH1 及与其结合蛋白

在180 ku 处看到过表达的Flag-SASH1 蛋白(图3)。

图3 SBP-pull down 实验和Western blot 实验证实SASH1 蛋白复合物中有Flag-SASH1 的表达Fig 3 SASH1 protein complex expression of Flag-SASH1 confirmed by SBP-pull down and western blot

2.4 SASH1 相互作用蛋白的质谱鉴定

SASH1 本身的评分很高(200.3)，总共有37 条SASH1 蛋白的肽段，其中20 条为SASH1 的特异性肽段(表1，2，图4)。图3 中仅列出SASH1 蛋白的部分质谱图。分析发现与SASH1 结合的分子中，MAP2K2 和MAP4K4 参与ERK 信号通路的调节。而且，质谱数据分析显示:MAP2K2 和MAP4K4 的评分也比较高(10.2 和20.3)，MAP4K4 鉴定到2 条肽段，其中1 条为特异肽段。MAP2K2 鉴定到1 条肽段。KEGG pathway database 显示:1) MAP2K2(MEK2)在细胞中定位于 MAPK 信号通路;2)MAP4K4通过MEKK1 间接激活MAP2K2。因此，SASH1 可能与MAP4K4 和MAP2K2 直接或者间接结合，进而调节ERK 信号通路。

表1 LC-MS/MS 鉴定出的与SASH1 有互相作用的蛋白信息Table 1 Information about SASH1 binding proteins identified by LC-MS/MS analyses

表2 LC-MS/MS 串联质谱分析SASH1 蛋白复合物的肽段Table 2 The peptides of SASH1 protein complexes by LC-MS/MS mass

图4 LC-MS/MS 质谱鉴定SASH1、MAP2K2 和MAP4K4 蛋白质谱图Fig 4 SASH1，MAP2K2 and MAP4K4 protein spectrum identified by LC-MS/MS mass spectrum

2.5 免疫沉淀证实SASH1 与MAP2K2 和MAP4K4具有相互作用

在171 ku 处看到MAP4K4 的条带，在50 ku 处看到 MAP2K2 的条带，SASH1 与 MAP2K2 和MAP4K4 均结合。表明 SASH1 在细胞中与MAP2K2 和MAP4K4 均存在相互作用(图5)。

2.6 SASH1 的表达抑制调节ERK1/2 的磷酸化水平

SASH1-siRNA 组SASH1 蛋白较空白和NegativsiRNA 对照组明显减少(P＜0.05)(图6)，表明RNA 干扰成功(图6)。SASH1-siRNA 组P-ERK1/2蛋白表达与空白和Negativ-siRNA 对照组相比明显增加。P-ERK1/2 相对含量也表明SASH1-siRNA 组P-ERK1/2 含量增加。提示SASH1 的表达抑制能够增强ERK1/2 的磷酸化水平(图7)。

图5 免疫沉淀证实与SASH1、MAP2K2 和MAP4K4 结合Fig 5 Immunoprecipitation confirmed that SASH1 binded with MAP2K2 and MAP4K4

图6 siRNA 干扰后SASH1 的表达和相对含量Fig 6 The expression of SASH1 and relative content knockdown by two pairs of siRNA

3 讨论

SASH1 是SLY 家族成员的一种信号调节蛋白质，具有SH3 and SAM 结构域，在这些蛋白与蛋白间相互作用的结构域中，这些结构域使SASH1 在蛋白质信号传导级联可能有重要作用［4］。该基因可在多种组织中表达，其表达减少与肿瘤的生长，入侵，转移和预后不良密切相关。多项研究发现SASH1 在乳腺癌、肺癌、胃癌等表达下调或缺失［5］。研究结肠癌和人脑胶质瘤U251 细胞发现，在有侵袭和转移肿瘤中SASH1 表达显著下调，其表达减少与肿瘤的侵润性生长和转移的形成等相关［7-8］。骨肉瘤组织的SASH1 表达率明显低于正常骨组织，且有肺转移者的癌组织中表达率显著低于无转移者，也提示SASH1 的缺失或抑制在肿瘤的发生，侵润和骨肉瘤转移中起重要作用［4］。然而SASH1 在肿瘤细胞中的增殖和转移等的确切机制不是完全清楚。

图7 SASH1-siRNA 组phospho-ERK1/2 的表达Fig 7 the expression of phospho-ERK1/2 in group of SASH1-siRNA

MAPK 信号通路中的Ras/Raf/MEK/ERK 通路可被多种刺激活化，调节细胞生长、发育、分裂和凋亡等多种生理反应过程，若持续活化可促进细胞增殖和恶性转化，与肿瘤的发生发展及细胞增殖、迁移和侵袭等密切相关［9］。最近发现SASH1 作为TLR4 信号通路的复杂下游组件可激活早期内皮反应受体［10］。MAP2K2 和MAP4K4 广泛分布于各组织中，可被多种细胞外信号激活，活化后可参与细胞凋亡、分化、增殖和恶性转化等多种生物学功能。其在人类许多类型癌症和癌细胞系中过表达，其中约有一半的胰腺导管腺癌组织与正常组织相比呈过表达现象［11-12］。本实验质谱结果提示，MAP4K4通过MEKK1 间接激活MAP2K2。MAP4K4 很可能通过Rac1-MEKK1-MAP4K4-JNK 途径影响受体信号，在细胞的迁移和入侵中发挥重要作用［13］。MAP4K4 激酶的活性对Ras 诱导的转化起重要作用，而Ras 可激活MEK/ERK 途径发挥作用。因此，推测SASH1 是否通过ERK 信号传导途径调节细胞增殖及迁移等多种细胞功能的发生。

本研究结果显示SASH1 与ERK 信号通路的重要分子MAP2K2 和MAP4K4 存在蛋白-蛋白相互作用，而且SASH1 的表达抑制能够增强ERK1/2 的磷酸化水平。提示SASH1 可能通过与MAP2K2 和MAP4K4 直接或间接的结合参与ERK 信号通路，对其进行调节并存在新的“串话”，进而调节肿瘤细胞的增殖、转移和凋亡等细胞过程的发生，但它们相互作用的具体机制还需更进一步深入研究，为肿瘤的发生机制提供新的理论基础和治疗靶点。

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