多不饱和脂肪酸改善小鼠心肌脂质成分及缺血再灌注后线粒体功能

张晓霞，赵子健，戴一凡，李 斌，米树华*

(1.首都医科大学附属北京安贞医院特需医疗科，北京100029;2.南京医科大学代谢疾病研究中心，江苏南京210029)

ω-3 多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids PUFAs)具有抗炎、改善血脂及减轻动脉硬化等多种作用。其与ω-6 PUFAs 在体内的平衡对心血管系统的正常功能具有重要意义［1-2］。普通动物源性脂肪含ω-3PUFAs 甚少，增加常见植物油脂摄入对心脏多不饱和脂肪酸比例的影响尚缺乏研究。本研究初步探讨以植物油脂代替动物脂肪摄入对心肌ω-6/ω-3多不饱和脂肪酸比例以及缺血再灌注时心肌损伤程度的影响及其机制。

1 材料与方法

1.1 材料

SPF 级雄性C57BL/6 小鼠80 只，体质量(25 ±2)g［斯贝福公司，合格证号:SCXK(京)2011-0004］。饲料(华阜康公司)。氯化三苯四氮唑(TTC)、伊文思蓝、不饱和脂肪酸标准品(Sigma 公司)。反转录试剂盒(Promega 公司)。Real-time PCR 试剂盒(宝生物工程公司)。TNF-α 及IL-1 ELISA 试剂盒(BG 公司)。

1.2 动物分组与处理

小鼠随机分为普通饮食组(n =40)、植物油脂组(n=40)。植物油脂组去除普通饲料中部分动物脂肪，按照25 g/kg 添加大豆油和花生油(1∶1)。饲养1 个月后，每组随机取8 只小鼠作为基线对照，行假手术，开胸后只穿线，不结扎。其余小鼠常规建立心脏缺血再灌注模型［3］。缺血30 min，再灌注3 h。

1.3 TTC 染色

心脏去除心房和大血管，0.9%氯化钠注射液清洗，吸干水分，－20 ℃冰箱冷冻固定20 min，自心尖起每隔1 mm 垂直于心脏长轴将心脏切成薄片，置于37 ℃1% TTC 溶液中，37 ℃水浴10 min。之后，将心肌薄片置于体式显微镜10 倍放大后拍照。尼康图像分析仪进行分析。测量左心室面积(area of left ventricle LV)、缺血面积(area at risk AAR 伊文思蓝未着色，TTC 染为砖红色)和梗死面积(infarction size IS TTC 染色呈灰白色)。缺血面积% =AAR/LV×100%，梗死面积% =IS/AAR×100%。

1.4 线粒体呼吸控制率的检测

将心脏用0.9%氯化钠注射液清洗，剪下左心室未被伊文斯兰着色的心肌，冰预冷匀浆介质中剪碎，轻柔匀浆，4 ℃，600 ×g 离心10 min 后，取上清液再以4 ℃，8 000 ×g 离心15 min，匀浆介质洗涤，沉淀即为纯化的心肌线粒体，加适量匀浆介质重新悬浮，双缩脲法测定蛋白浓度。耗氧检测系统测定温度25℃，调节最大相对氧浓度和氧零值，线粒体终浓度1 g/L，记录基线后加入外源底物琥珀酸(2.5 mmol/L)，出现IV 态呼吸，记录2 min 后，加入二磷酸腺苷(ADP，100 mmom/L)，出现III 态呼吸，计算线粒体呼吸控制率(respiratory control rate，RCR)即III 态与IV 态呼吸速率之比，反应线粒体膜完整性和氧化磷酸化的耦联程度。

1.5 实时定量PCR 法检测缺血区TNF-α mRNA的表达

采用Trizol 提取、酚仿抽提乙醇重新沉淀的方法提取缺血区心肌组织总RNA，以Random primer为引物，按照试剂盒说明书操作，以总RNA 为模板反转cDNA。实时荧光定量PCR 检测心肌中TNF-α 表达，以β-actin 做为内参照物，根据CT 值计算TNF-α的相对表达量。引物:TNF-α 上游:5'-GTCCCCAA AGGGATGAGAAG-3'，下游:5'-CACTTGGTGGTTTG CTACGA-3';内参照β-actin:上游:5'-GTCCCTCACC CTCCCAAAAG-3' 下游:5'-GCTGCCTCAACACCTCA ACCC-3'。

1.6 ELISA 法检测缺血区心肌中TNF-α 及IL-1含量

心肌组织匀浆离心后，留取上清液，双缩脲法进行蛋白定量，严格按照试剂盒说明书检测TNF-α及IL-1 含量。

1.7 心肌ω-6 及ω-3 不饱和脂肪酸的测定

甲醇-氯仿提取心肌中的脂质，以14% BF3/MeOH 酯化后进行气相色谱分析。起始温度45 ℃4 min，然后以13 ℃/min 递增至175 ℃，保持27 min。再以4 ℃/min 增加至215 ℃，保持35 min。通过将保留时间与标准品对比，分析脂肪酸含量。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 心脏ω-6 及ω-3PUFAs 的含量

植物油脂组小鼠心脏ω-6PUFAs、AA 含量及ω-6/ω-3PUFAs 比例均显著低于普通饮食组(P＜0.05)(表1)。

2.2 心肌梗死面积的比较

植物油脂组小鼠心肌梗死面积为31.5% ±4.5%，显著低于普通组的50.1% ±3.8%(n =8，P＜0.01)(图1)。

2.3 缺血区心肌线粒体呼吸控制率

植物油脂组线粒体RCR 显著高于普通组(P＜0.05)，但均显著低于假手术组(P＜0.01)(图2)。

表1 心脏PUFAs 含量及ω-6/ω-3PUFAs 比例的比较Table 1 Comparison of the content of PUFAs(mg/ml)and the ratio of ω-6/ω-3PUFAs in the heart(±s，n=8)

表1 心脏PUFAs 含量及ω-6/ω-3PUFAs 比例的比较Table 1 Comparison of the content of PUFAs(mg/ml)and the ratio of ω-6/ω-3PUFAs in the heart(±s，n=8)

＊P＜0.05 compared with ordinary diet group.

groupLAAAEPADHAω-6/ω-3 ordinary diet5.16 ±1.901.72 ±0.630.17 ±0.06 2.90 ±1.512.38 ±0.38 plant oil2.61 ±0.50*0.87 ±0.17*0.12 ±0.011.65 ±0.411.99 ±0.18*

图1 心肌梗死面积的比较Fig 1 Comparision of the infarction size(n=8)

图2 呼吸控制率的比较Fig 2 Comparision of the respiration control rate(n=8)

2.4 缺血区心肌组织TNF-α mRNA 的表达及TNF-α 与IL-1 的蛋白含量

缺血再灌注后，普通组及植物油脂组小鼠心肌组织中TNF-α 的mRNA 表达均较缺血前显著增高(P＜0.01)，而植物油脂组显著低于普通组(P＜0.05)(图3)。与缺血前相比，普通组和植物油脂组TNF-α 及IL-1 含量均显著增高，而植物油脂组明显低于普通组(表2)。

图3 缺血区TNF-α mRNA 表达的比较Fig 3 Comparision of the expression of TNF-α mRNA in area at risk(n=6)

3 讨论

ω-3PUFAs 可降低冠心病患者的病死率，减少心性猝死［4］。植物油富含单及多不饱和脂肪酸，以普通植物油为脂肪酸主要来源的饮食，对心肌ω-6/ω-3 不饱和脂肪酸比例以及心肌缺血再灌注时损伤程度的影响尚不明确。

表2 缺血区TNF-α 及IL-1 含量的比较Table 2 Comparision of the TNF-α and IL-1 in area at risk(±s，n=8)

表2 缺血区TNF-α 及IL-1 含量的比较Table 2 Comparision of the TNF-α and IL-1 in area at risk(±s，n=8)

*P＜0.01 compared with the content before I/R;#P＜0.05 compared with the ordinary diet group.

ordinary diet groupplant oil group before I/Rafter I/Rbefore I/Rafter I/R TNF-α(pg/mg)6.50 ±0.7637.09 ±8.30*5.13 ±1.0923.27 ±9.61*#IL-1 (Pg/mg)9.09 ±1.2658.33 ±16.58*9.59 ±1.2139.03 ±10.37*#

本研究显示，以未被加热氧化的植物油代替饲料中的部分动物脂肪成分，可降低心肌细胞膜ω-6/ω-3 多不饱和脂肪酸比例。其可能与动物脂肪中含有较高比例的ω-6 不饱和脂肪酸、及多不饱和脂肪酸吸收后在体内的不同分布有关。

ω-3 PUFAs 具有明显的抗炎性反应作用。二十碳五烯酸(eicosapentaenoic Acid，EPA)可与花生四烯酸(arachidonic acid，AA)竞争环氧化酶(cyclooxygenase，COX)和脂氧化酶(lipoxygenase，LOX)的结合位点，影响前列腺素类化合物的代谢，生成无生物活性的血栓素A3(thromboxane A3，TXA3)。而由EPA 代谢而来的前列环素I3(prostacyclin I3，PGI3)却具有同等强度的抗血小板聚集作用。同时，COX-1 和COX-2 代谢EPA 的效率只有AA 的10%～30%［1］。EPA 的LOX 代谢产物白细胞三烯B5(leucotriene B5，LTB5)的致炎作用也显著弱于AA 来源的LTB4［2］。一些文献报道了ω-3 PUFAs 可显著改善体外循环术后炎性因子IL-6的升高［5］、抑制内毒素诱导的巨噬细胞内NF-κB信号激活及其细胞因子表达［6］及抑制前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)刺激后基质细胞炎性反应过程［7］等。EPA 还可抵消3T3-L1 脂肪细胞中AA 导致的血管紧张素II 分泌［8］。

缺血再灌注损伤在某种程度上是一个强烈的炎性反应损伤过程。氧自由基的大量产生使心肌微粒体及质膜上的脂加氧酶和环加氧酶激活，代谢AA 产生PGE2 及TXA2 等炎性因子。单核和巨噬细胞激活后产生大量TNF-α 和IL-1β，加速中性粒细胞和单核细胞浸润心肌组织，释放大量的氧自由基，导致心肌细胞的坏死和凋亡。本研究显示，植物油脂组小鼠缺血区TNF-α 的mRNA 表达显著下降，TNF-α 和IL-1β 蛋白含量显著减低，提示炎症过程被显著抑制。植物油脂组小鼠线粒体呼吸控制率显著改善，提示炎性反应的减弱显著改善了缺血区心肌线粒体的功能。线粒体功能的改善提高了心肌ATP 供应、减少氧自由基的进一步产生，对于改善再灌注损伤具有重要意义。

综上，适当以植物油代替动物脂肪摄入可改善心肌ω-6PUFAs 和ω-3PUFAs 比值，改善心肌缺血再灌注损伤，其临床意义有待进一步研究。

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