全反式维甲酸促使小鼠白色脂肪细胞棕色化

王 姣，孙高洁，王守俊

(郑州大学第一附属医院内分泌及代谢病科河南省高等院校临床医学重点实验室，河南郑州450052)

哺乳动物体内存在两种不同类型的脂肪细胞，即棕色脂肪细胞和白色脂肪细胞。和主要用于储存能量的白色脂肪组织相比，棕色脂肪组织因线粒体表达解偶联蛋白1(uncoupling protein-1，UCP1)而拥有非颤栗产热的能力，研究表明体内高水平的棕色脂肪组织可阻止代谢性疾病的发生［1］。全反式维甲酸(all-trans-retnoic acid，t-RA)对哺乳动物细胞的分化、生长有重要作用，有动物实验表明，t-RA 有促使大鼠白色脂肪表现出棕色脂肪表型的倾向［2］。本实验通过研究t-RA 对小鼠白色脂肪细胞棕色化的影响，为开辟新的治疗肥胖症、糖尿病等代谢性疾病的方法提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞培养及分化:小鼠3T3-L1 前脂肪细胞(武汉博士德公司)在37 ℃、5% CO2环境中培养于含10%胎牛血清的高糖培养液中，当细胞汇合达80%时，胰蛋白酶消化、传代。细胞完全汇合后2 d(诱导分化第0 天)，用以下试剂诱导分化:0.5 mmol/L 的IBMX、1.0 μmol/L 的地塞米松和2 mg/L的胰岛素。在48 h(第2 天)后换液，培养中仅有1.0 μmol/L的地塞米松、2 mg/ L 的胰岛素，第4 天及以后的换液，不加任何诱导因素，至第8 天。

1.2 油红O 法鉴定细胞分化:小心轻缓倒去培养液，用PBS洗2 次，10%甲醛固定30 min，加油红O 工作液静止10 min，后用75%乙醇漂洗。加苏木精静止5 min 后，用PBS 漂洗2遍。甘油明胶封片，普通显微镜下观察。

1.3 RT-PCR 测UCP1 mRNA 的表达:细胞以8 ×104个/孔接种于6 孔板，贴壁24 h，分别以0、1 × 10－5、1 × 10－4、1 ×10－3、1 ×10－2及1 ×10－1mmol/L t-RA 作用24 h。提取RNA，用分光光度计测量RNA 浓度，反转录得到cDNA，进行PCR 反应。UCP1 上、下游引物分别为5'-GTACCACATAAG CAACTTGGAG-3'和5'-ATCTTGTAATGTAAATAAAGTC-3'(扩增片段长度为106 bp)，β-actin 上、下游引物分别为5'-GA GACCTTCAACACCCCAGC-3'和5'-AGCATTGTAGGTCCCCGT GT-3'(扩增片段长度为292 bp)。UCP1 mRNA 表达水平以UCP1 与β-actin 吸光度比值表示。

1.4 Western blot 测UCP1 蛋白表达:细胞以8 ×104个/孔接种于6 孔板，贴壁24 h，分别以0、1 ×10－5、1 ×10－4、1 ×10－3、1 ×10－2及1 ×10－1mmol/L 全反式维甲酸作用24 h。提取蛋白，BCA 法测蛋白浓度;SDS-PAGE 电泳;蛋白质转移至硝酸纤维素膜上，室温封闭2 h;一抗4 ℃孵育过夜;辣根过氧化物酶标记二抗室温孵育1 h;Image Studio Ver 2.0 软件测吸光度值，UCP1 蛋白表达水平以UCP1 与β-actin 吸光度比值表示。

2 结果

2.1 小鼠3T3 前脂肪细胞诱导分化后形态改变(图1，2)

2.2 RT-PCR 结果显示(图3，表1)

2.3 Western blot 结果显示(图4，表1)

图1 3T3-L1 前脂肪细胞分化前的形态Fig 1 3T3 －L1 preadipoctes are fibroblasts(×100)

图2 3T3-L1 前脂肪细胞分化诱导8 d 时油红O染色后的形态Fig 2 On the 8th day after induction with hormones the fat droplets in adipocvte were stained by red-oil-O(×200)

3 讨论

维甲酸对哺乳动物脂肪代谢的生化过程包括脂肪细胞分化、适应性热代谢、脂肪酸氧化分解等有重要影响。啮齿类动物实验研究发现维甲酸有减轻体质量，升高体温，提高胰岛素敏感性，促进脂肪分解的作用，并且可以促使棕色脂肪组织和骨骼肌表达UCP1。t-RA 具有促进细胞分化的作用，对细胞内外离子分布、细胞间物质转运、氨基酸摄取和蛋白质合成代谢酶的表达都有影响。本实验将t-RA 以不同浓度作用于小鼠白色脂肪细胞24 h，检测UCP1 mRNA 及蛋白的表达情况。结果表明，t-RA 可以促使小鼠白色脂肪细胞表达UCP1 即促使白色脂肪细胞发生棕色化。但t-RA促使白色脂肪组织发生“棕色化”的机制仍未明确。有研究发现单独使用过氧化物酶体增殖物激活受体α (peroxisome proliferator-activated receptor-α，PPARα)激动剂不能促使“棕色化”的发生，除非联合使用维甲酸，同时认为PPARα促使“棕色化”的发生有可能前提需激活有丝分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)［3］。那么t-RA促使小鼠白色脂肪棕色化是否是因为激活了MAPKs 信号通路，这些信号通路的激活是否是“棕色化”发生的必要条件，这有待进一步探索。

图4 不同浓度全反式维甲酸处理的小鼠脂肪细胞UCP1 蛋白的表达水平Fig 4 Expression levels of UCP1 protein in mice adipocytes after treatment with t-RA at various concentrations

表1 RT-PCR 及Western blot 检测不同浓度全反式维甲酸处理的小鼠脂肪细胞UCP1 mRNA 及蛋白的表达Table 1 RT-PCR and Western blot showed that expression levels of UCP1 mRNA and protein in mice adipocytes after treatment with t-RA at various concentrations (±s，n=3)

表1 RT-PCR 及Western blot 检测不同浓度全反式维甲酸处理的小鼠脂肪细胞UCP1 mRNA 及蛋白的表达Table 1 RT-PCR and Western blot showed that expression levels of UCP1 mRNA and protein in mice adipocytes after treatment with t-RA at various concentrations (±s，n=3)

＊P＜0.01 compared with blank control group.

group0(blank control)10 －510 －410 －310 －210－1 UCP1 mRNA00.49 ±0.014*0.68 ±0.019*0.33 ±0.018*0.23 ±0.008*0.26 ±0.014*UCP1 protein00.31 ±0.014*0.39 ±0.013*0.25 ±0.017*0.28 ±0.013*0.23 ±0.016*

［1］Jorge Ivan Castillo-Quan.From white to brown fat through the PGC-1α-dependent myokine irisin:implications for diabetes and obesity［J］.Dis Model Mech，2012，5:293 －295.

［2］J.Mercader，J.Ribot，I.Murano，et al.Haploinsufficiency of the retinoblastoma protein gene reduces diet-induced obesity，insulin resistance，and hepatosteatosis in mice［J］.Endocrinol.Metab，2009，297，184 －193.

［3］Guillaume E.Beranger，Michael Karbiener，Valentin Barquissau，et al.In vitro brown and“brite”/“beige”adipogenesis:Human cellular models and molecular aspects［J］.Biochimica et Biophysica Acta，2012，104:7 －18.