小鼠CSE基因启动子克隆及其活性测定

王茂先

(韩山师范学院生物学系，广东潮州521041)

基因表达调控机制是后基因组时代一个重要的研究内容。基因启动子是各种转录因子结合的区域，不同的转录因子对基因的表达调控起着不同的作用，基因的表达是这些转录因子共同作用的结果［1-2］。硫化氢(hydrogen sulfide，H2S)是一种具有臭鸡蛋味道的有毒气体，也是继一氧化碳(NO)和一氧化氮(CO)之后的第3 种气体信号分子［3-5］。硫化氢是新近发现的继NO 和CO 后的第3 个内源性气体信使，有多生物学功能，如它参与低氧性肺动脉高压、感染性休克、急性肺损伤等多种疾病的病理生理过程［6-10］。胱硫醚γ-裂解酶(cytathiohine γ-lyase，CSE)是人类和哺乳动物细胞利用半胱氨酸或者同型半胱氨酸生成H2S 的3 种酶之一，另外两种酶是胱硫醚β-合成酶(cytathiohine β-synthase，CBS)和3-硫基丙酮酸硫基转移酶(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase，3MST)［11-14］。许多研究表明，H2S/CSE 可能涉及大量诸如心肌缺血、动脉硬化、高血压等心血管疾病的病理生理过程［15］。因此，研究胱硫醚γ-裂解酶基因启动子与基因表达调控的关系具有重要的意义，不但可以阐明相关疾病发生的分子机制，而且有可能找到相关疾病治疗的药物新靶标。

1 材料与方法

1.1 实验材料

血液基因组DNA 小量抽提试剂盒(Axygen 公司)。DNA 凝胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒和质粒中量提取试剂盒I(Biomiga 公司)。Trans5α感受态细胞、1 kb DNA Ladder Marker、Trans 2 kb DNA Marker、Trans 2 kb Plus II DNA Marker、Trans 8 kb DNA Marker 等DNA Marker (北京全式金生物技术有限公司)。LA Taq、dNTP mix、XhoⅠ和KpnⅠ限制性内切酶、碱性磷酸酶(BAP，含该酶的相关buffer)、T4 DNA Ligase 等试剂(TaKaRa 公司)。pGL4.12 质粒、Dual-Luciferase® Reporter Assay System 试剂盒(Promega 公司)。Xfect® 转染试剂盒(Clontech 公司)。DEME(高糖，不含丙酮酸钠)、RPMI-1640、DMEM/F12 1∶1 培养基、1 ×DPBS(不含钙、镁、酚红)、1 ×0.25%胰蛋白酶/EDTA、南美胎牛血清、L-谷氨酰胺溶液(200 mmol/L)、青霉素/链霉素溶液(10 000 U/L 青霉素，10 000 μg/L 链霉素，溶于0.9%氯化钠注射液)等细胞培养相关的试剂［赛默飞世尔科技(中国)有限公司］。HEK-293 细胞和COS-7细胞两种哺乳动物细胞系［中国科学院上海生科院细胞资源中心)。成年昆明小鼠/Slac(25 ～30 g)(清洁级，性别随机，动物合格证号SCXK(沪)2003-0003 号，上海斯莱克实验动物有限公司］。

1.2 实验方法

1.2.1 小鼠基因组DNA 提取:取小鼠眼底血，收集4.5 ×10－4L 昆明小鼠的血液，加入5 ×10－5L 质量百分数为8%的柠檬酸钠溶液。运用血液基因组DNA 小量抽提试剂盒，抽提小鼠DNA 基因组。具体步骤，详见试剂说明书，1% 琼脂糖凝胶电泳鉴定(图1A)。在GenBank 数据库中搜索到小鼠CSE 基因启动子的序列，设计上下游引物，目标片段DNA长1 716 bp(－1691 ～+25 nt)。

1.2.2 引物设计、PCR 扩增、连接pGL4.12 载体测序:根据GenBank 数据库中小鼠CSE 基因启动子序列(AC_000025.1)，用Primer Premier 5.0 软件设计特异性PCR 引物(表1)，CSE 基因启动子引物为F 和R，下划线序列为限制性酶切位点，上游为KpnⅠ，下游为XhoⅠ，引物由上海博尚生物技术公司合成。应用LA Taq，以小鼠基因组DNA 为模板进行CSE 5'侧翼区片段PCR 扩增，反应体积为5 ×10－5L，反应条件为:94 ℃3 min，94 ℃30 s，56 ℃30 s，72 ℃2 min 30 s，进行30 个循环，然后72 ℃10 min，4 ℃保存。扩增产物经1%琼脂糖电泳鉴定，DNA 胶回收试剂盒回收纯化。将克隆的小鼠CSE 基因5'侧翼区片段命名为KM1716，连接到pGL4.12 载体上，构建重组载体命名为pGL4.12-KM1716，连接产物转化到Trans 5α感受态细胞中，37 ℃培养过夜，挑取单菌落，37 ℃摇床培养过夜。高纯度质粒小提试剂盒抽提质粒后进行限制性酶切分析，经鉴定片段大小正确后，送至上海博尚生物技术公司测序，测序结果与GenBank 数据库中的公布序列比对分析。

表1 PCR 引物信息Table 1 The primer's information of PCR

1.2.3 小鼠CSE 基因启动子生物信息学:分析对克隆测序获得的小鼠CSE 基因5'侧翼区域利用启动子在线预测与分析软件Neural Network Promoter Prediction(http://fruitfly．org:9005/seq_tools/promoter．html)、Promoter 2.0 Prediction Server(http://www．cbs．dtu．dk/services/Promoter/)和McPromoter(http://tools．genome．duke．edu/generegulation/Mc-Promoter/)预测并分析启动子区。最后结合文献报道并应用CpG island 预测软件CpG Island Searcher(http:/ /www．uscnorris．com/cpg-islands2/cpg．aspx)和在线软件TFSEARCH(http://mbs．cbrc．jp/research/db/TFSEARCH．html)分析预测CpG 岛和一些转录因子结合位点。

1.2.4 pGL4.12-KM1716 荧光蛋白报告载体的构建和细胞培养:用KpnⅠ和XhoⅠ，对pGL4.12 和KM1716 双酶切后，分别胶回收线性pGL4.12 和KM1716 片段，并用T4 DNA Ligase 16 ℃过夜连接，连接产物转化Trans 5α 感受态细胞，37 ℃培养过夜，挑取单菌落，37 ℃摇床培养过夜。高纯度质粒小提中量试剂盒抽提质粒后，进行限制性酶切鉴定。送至上海博尚生物技术公司测序，经鉴定亚克隆的片段正确后，用于后续的实验中。

野生型的HEK-293 细胞和转染有pGL4.12-KM1716 的HEK-293 细胞培养在含有10%胎牛血清、10 ×105U/L penicillin G、100 g/L streptomycin、6.5 mmol/L L-glutamine 的高糖DMEM 培养液中，37 ℃、5% CO2、饱和湿度培养。野生型的COS-7 细胞和转染有pGL4.12-KM1716 的COS-7 细胞培养在含有10% 胎牛血清、10 ×105U/L penicillin G、100 g/L streptomycin、4.05 mmol/L L-glutamine 的RPMI 1640 培养液中，37 ℃、5% CO2、饱和湿度培养。

1.2.5 pGL4.12-Km1716 在HEK193 细胞和COS-7细胞中的表达:转染前1 d，将生长状态良好的HEK-293 细胞和COS-7 细胞，用胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，调整细胞数为2 ×105/孔，接种至3.5 cm 培养皿中，继续培养。次日等细胞汇合率达90%时进行瞬时转染，具体步骤，详见试剂说明书。转染后的细胞在24 h 后，HEK-293 细胞和COS-7 细胞后，测定萤火虫萤光素酶和海肾荧光素酶的活性。荧光强度采用Dual-Luciferase® Reporter Assay 试剂在SpectraMax® microplate reader 仪器进行测定萤火虫和海肾荧光素酶的活性，用倍数关系表示CSE 基因启动子的相对活性。

2 结果

2.1 小鼠CSE 基因5'侧翼区的扩增

昆明小鼠/Slac 血液基因组DNA，在1.0% 琼脂糖凝胶电泳检测中，出现单一条带(图1A)。PCR产物出现单一的目的条带，片段大小与预期相符，为1 716 bp(图1B)。酶切后的pGL4.12-KM1716 重组质粒，在电泳图谱中，出现两条单一条带(1.7 kb 和4.4 kb)，分别为CSE 基因启动子片段和pGL4.12空载(图1C)。测序后，经过比对，确定为小鼠CSE基因5'侧翼区序列，并且与GenBank 数据库中报道的序列同源性为99%。

图1 小鼠CSE 基因启动子的克隆及重组质粒的鉴定Fig 1 Identification of recombinant plasmid and cloning of CSE gene promoter

2.2 小鼠CSE 基因启动子的生物信息学分析

运用CpG 在线预测工具(http:/ /www．uscnorris．com/cpg-islands2/cpg．Aspx)分析，发现所扩增小鼠CSE 基因启动子没有符合条件的CpG 岛，得到该序列中碱基C 和G 的含量之和为48.95%。在线预测工具TFSEARCH(http://mbs．cbrc．jp/research/db/TFSEARCH．html)分析得知，CSE 基因启动子上的转录因子结合位点检测分值在92 分以上的有25个。其中，GATA 结合因子(GATA-binding factor，GATA)有4 个，SRY 有3 个，上游刺激因子(upstream stimulatory factor，USF)有2 个，髓锌指蛋白1(myeloid zinc finger protein 1，MZF1)有2 个，含有MYB 结构域的一类转录因子(v-Myb)有2 个，CdxA有2 个，TATA 盒(TATA box)有1 个，急性髓系白血病-1a(Acute myeloid leukaemia-1a，AML-1a)有1个，RORalp 有1 个，C/EBP 有1 个，Nkx-2 有1 个，Lyf-1 有1 个，N-Myc 有1 个，热休克因子2(heat shock factor 2，HSF2)有1 个，E2F 有1 个。CSE 基因启动子的生物信息学分析结果(表2)。

表2 CSE 基因启动子的生物信息学分析Table 2 Results of the bioinformatics analysis of CSE gene promoter

2.3 小鼠CSE 启动子的活性测定

报告基因分析是通过瞬时转染培养在细胞培养基中的来进行的。用倍数关系表示CSE 基因启动子的相对活性。检测结果发现，pGL4.12-KM1716 在HEK-293 细胞和COS-7 细胞中表达的活性，与空载体pGL4.12 在两种细胞中的活性相比，分别是17.6±2.1 倍和12.4±1.2 倍(图2)。结果表明，KM1716 片段具有CSE 核心启动子的转录调节活性，能够用于哺乳动物细胞CSE 转录和表达调控方面的研究。

图2 pGL4.12-KM1716 在HEK-293 细胞和COS-7细胞中表达的相对活性Fig 2 Relative activity of expression of pGL4.12-KM1716 in HEK-293 and COS-7 cells(±s，n=4)

3 讨论

近年来，内源性硫化氢在神经系统、心血管系统等方面的生理作用，主要表现为参与一些疾病的病理过程，同时，其在药物开发的前景等方面也越来越引起人们的重视［8］。硫化氢在各种心血管组织中，主要经胱硫醚γ-裂解酶催化内源性生成。在体循环血管、肺循环血管及其他血管组织中起着舒张血管、促进血管新生、抑制血管平滑肌细胞增殖并调控其表型转化等生物学效应［9］。通过转染的HEK-293 细胞研究发现，小鼠CSE 基因核心调控区包括5'侧翼区近端375 bp 的启动子区(－357 ～+18)［14］。运用pGL3 萤光素酶报告基因技术，研究了CSE 基因启动子3.5 kb(－3 498 ～+18)瞬时转染在RAW264.7 细胞中的活性。发现LPS 处理RAW264.7 细胞后，CSE 基因启动子活性随LPS 浓度梯度的变化而升高，但是地塞米松抑制这种效应［13］。pGL4.12-KM1716 表达载体在HEK-293 细胞和COS-7 细胞中都具有很强的萤光素酶的活性(图2A，B)，这表明小鼠CSE 基因近端启动子在不同的哺乳动物细胞(人和小鼠等)中具有调控CSE 基因转录和表达的能力。同时，发现小鼠CSE基因启动子(－1 691 ～+25)存在一些重要的转录因子结合位点，如TATA 盒、GATA、HSF2 等，这些转录因子结合位点可能对于CSE 基因的转录和表达调控起着重要的作用。CSE 启动子上MZF-1 和Sp1 结合位点发生突变，能够显著地影响转染在HEK-293细胞和COS-7 细胞中CSE 基因启动子的活性，表明这些转录因子涉及到基本转录活性。相反地，移除AML-1a、USF-1 和N-Myc 转录因子结合位点共有序列，能够增加HEK-293 细胞中CSE 基因启动子活性，这表明这些转录因子具有作为抑制元件而起作用的［14］。

在心血管、炎性反应等方面的疾病治疗性研究方面，CSE 基因启动子的研究工作具有其优越性。本研究获得的CSE 基因启动子具有启动萤光素酶基因的表达能力，这为进一步CSE 基因转录调控机制的研究奠定了实验和理论基础。特别要强调的是，CSE 基因启动子上一些重要的转录因子的可能结合位点，存在重要的临床研究价值(如作为药物的作用靶标等)，有利于深入研究其生物学功能和医药方面的重要作用。

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