与泌尿生殖窦间质细胞共培养诱导hUC-MSCs定向分化为前列腺上皮样细胞

李 望，高维强

(上海交通大学医学院附属仁济医院干细胞研究中心，上海200127)

干细胞的生长和分化、成熟与周围的微环境有关［1］。可能的机制是，干细胞在特定的微环境中受到周围细胞信号的影响，从而对新的微环境中的调节信号做出反应。例如神经干细胞在神经系统内几乎不增殖，只有当神经出现损伤时，才有可能被激活［2］。有研究表明［3］，心脏干细胞平时也不具有增殖能力，只有在特定的时候才会增殖分化。人的间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是多潜能的细胞［4］。许多研究报道，这类细胞能够分化成不同类型的细胞，例如可以分化成中胚层的组织包括骨、软骨、肌肉、韧带、肌腱和脂肪［5］。近年来人的脐带间充质干细胞(human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)成为研究的热点。由于hUCMSCs 具有组织样本容易获得、非侵入性的采集过程、并且采集脐带没有伦理道德上的争议，人们认为hUC-MSCs 是比较原始的细胞且干性更强，比其他组织的MSCs 免疫排斥性低，并且具有更强的可塑性和扩增能力等优点［6］。本研究的目的是想探索hUCMSCs 在体外特定的组织细胞微环境中是否能够被定向诱导分化成为前列腺上皮细胞。

1 材料与方法

1.1 材料

PE 偶联的CD105、FITC 偶联的CD29、APC 偶联的CD31、Per-Cy5.5 偶联的CD45 和PE-Cy7 偶联的CD34(eBioscience 公司);P63、AR、CK8、PSA 及vimentin 抗体(Santa Cruz 公司);睾酮、胶原蛋白酶IV 和胰蛋白酶(Sigma 公司);isopore 膜(Millipore 公司);胶原蛋白(collagen 胶)(BD 公司)。

1.2 泌尿生殖窦间质细胞的制备

泌尿生殖窦间质细胞的分离过程根据以往的研究报道［7］。从怀孕18 d 的SD 大鼠身上取出胚胎，处死并取下胚胎的泌尿生殖窦。把泌尿生殖窦间质与上皮分离后，把间质组织用1 mg/mL 的胶原蛋白酶Ⅳ联合0.125%的胰蛋白酶在37 ℃下消化30 min，将消化下来的细胞在改良Eagle 培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium，DMEM)中分散培养(DMEM 中加入10%胎牛血清，100 U/mL 青霉素和100 mg/mL 链霉素，10－8mol/L 雄激素)。大鼠泌尿生殖窦的间质细胞(rat urogenital sinus stromal cells，rUGSSs)长满培养皿后用胰蛋白酶消化传代，在培养基中培养两周后与hUC-MSCs 联合进行体外实验。

1.3 hUC-MSCs 的分离和制备

新鲜的人脐带从仁济医院产科的剖腹产手术中取得。获得仁济医院伦理委员会的批准及取得了产妇及亲属同意。脐带组织在70%的乙醇中消毒30 s并用0.9%氯化钠注射液彻底清洗。反复清洗直到血和血凝块洗净。为了避免内皮细胞的污染，脐血管用0.9%氯化钠注射液冲洗后用无菌的解剖刀切开。脐血管(动脉和静脉)移除，将暴露的华通氏胶组织切成小片［8］。切碎成1 ～2 mm3的碎片后用1 mg/mL的胶原蛋白酶IV 联合0.125%胰蛋白酶在37 ℃消化30 min。将消化之后的细胞用400 ×g 离心8 min，在PBS 中洗2 次。华通氏胶中提取的细胞放在含有8% 胎牛血清、100 U/mL 青链霉素的DMEM 培养基中培养。hUC-MSCs 在长满培养皿后传代，细胞在体外培养两周后与大鼠的泌尿生殖窦间质细胞联合进行体外实验。

1.4 流式细胞鉴定

使用标准的流式技术分析第4 代hUC-MSCs 细胞。用单阳性对照调补偿。细胞先标记CD105、CD29、CD45、CD34 和CD31 抗体后用BD FACSAria流式细胞仪分析细胞的纯度。

1.5 体外分化

hUC-MSCs 与大鼠的泌尿生殖窦的间质细胞混合，重悬在3 g/L 100 μL collagen 胶原蛋白中。将含有细胞的胶原蛋白放置在isopore 膜上(图3A，B，C)。把膜放在盛有DMEM 培养基的培养皿中培养，加睾酮终浓度在10－8mol/L(0.01 μmol/L)，每3 天更换新的培养基。两周后收集胶原蛋白并且将其做免疫荧光分析。用前列腺上皮细胞的标志物分析hUC-MSCs 的分化。

2 结果

2.1 hUC-MSCs 和大鼠的泌尿生殖窦的间质细胞的分离和鉴定

通过胶原蛋白酶联合胰蛋白酶消化的方法，由人脐带而来的细胞以1 000 个细胞/cm2的密度种在培养皿中。贴壁细胞呈现典型的成纤维状或多角形的形态学特征(图1A)。泌尿生殖窦的间质细胞较小并且呈成纤维状的外观(图1B)。

为了再次鉴定制备的hUC-MSCs，利用流式分析第4 代细胞。如图2，hUC-MSCs 表达CD29(图2D)、CD105(图2E)，但对于造血谱系的标志物CD34 阴性(图2F)，白细胞共同抗原CD45(图2G)阴性，血小板、内皮细胞黏附分子CD31 阴性(图2H)。流式分析得出CD29、CD105 双阳性的hUCMSCs 群体占整体的98.7%(图2C)。

图1 人脐带间充质干细胞和大鼠泌尿生殖窦间质细胞的形态特征Fig 1 The morphology and characterization of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells(hUC-MSCs)and rat urogenital sinus mesenchymal cells(rUGSSs)(×40)

2.2 hUC-MSCs 在体外分化

hUC-MSCs 与大鼠的泌尿生殖窦的间质细胞联合在三维立体胶中体外培养(图3A，B，C)，经睾酮诱导两周后将培养的细胞做免疫荧光分析显示，一些细胞表达前列腺上皮的标志物。包括基底细胞的标志物CK5(图3E)和P63(图3F)、腔细胞的标志物CK8(图3D)。这些发现提示，hUC-MSCs 在体外特异的组织细胞微环境中能够定向分化。

3 讨论

在正常的胚胎发生当中，前列腺是由泌尿生殖窦发育而来，泌尿生殖窦起源于泄殖腔的分叉。泌尿生殖窦是一个正中线的结构，由内胚层起源的上皮层和中胚层起源的基质细胞层所构成［9］。前列腺的发育、生长和细胞分化是由上皮和周围的间质微环境相互作用的结果［10］。在前列腺的发育、成熟过程中，雄激素的存在起了非常重要的作用［11］。这个过程包括间质诱导上皮的发育，以及上皮在发育过程中对间质的反作用。

干细胞存在于特定的微环境细胞中，微环境能够给予干细胞营养并且保持组织细胞的稳态。当干细胞存在的微环境由于某种原因发生了改变，就会给干细胞发出某种信号刺激。例如发出细胞再生的刺激、分化的刺激、凋亡的刺激、或者其他的刺激最终导致干细胞不同的命运［12］。

图2 流式细胞术检测人脐带间充质干细胞免疫表型Fig2 Immuno phenotypes of hUC-MSCs by flow cytometry

图3 人脐带间充质干细胞在体外分化Fig 3 Directed differentiation of hUC-MSCs in vitro(×100)

本研究中，利用rUGSSs 给hUC-MSCs 提供了增殖和分化的微环境，在雄激素的诱导作用下，在与rUGSSs 共培养的条件下分化出了前列腺上皮样细胞。可能细胞信号通路在细胞的增殖和分化中起了重要的角色。涉及到这个过程的信号分子还不太清楚。总之，本研究证明，利用hUC-MSCs 处于特异的组织细胞微环境中能够定向分化成特定的细胞。利用这种方法可以快速地诱导分化出特定的细胞类型。为组织工程、基础研究提供一个新的启示。

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