骨髓间充质干细胞抑制CD4+初始T细胞体外分化为Th17细胞

曲学彬，刘星霞，韩晶晶，姚瑞芹，赵春华

(1.徐州医学院基础学院生物学系，江苏徐州221009;2.中国医学科学院基础医学研究所组织工程中心，北京100005;3.徐州医学院临床学院神经内科，江苏徐州221002)

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs)不仅具有多向分化的潜能，而且还能够发挥重要的免疫调节功能［1-2］。研究发现，BM-MSCs 能够抑制T 细胞的增殖与活化，通过调节辅助T 细胞(helper T cell，Th)1(Th1)和2(Th2)的平衡而缓解相关免疫疾病的症状，促进调节性辅助T 细胞的生成而降低炎性反应［3-4］。此外，BM-MSCs 还能够调节近年来新发现的，与诸多自身免疫性疾病(如脑脊髓炎、类风湿关节炎等)密切相关的Th17 的增殖和分化［5-7］，体现了BM-MSCs在自身免疫性疾病临床治疗上的应用前景。然而，目前对BM-MSCs 调节Th17 功能的研究还不明确。胎儿BM-MSCs 能够在体外促进人Th17 的增殖与分化［5］，然而，BM-MSCs 能够通过抑制Th17 的分化生成而缓解自身免疫性疾病［6-7］。因此，BM-MSCs 调控Th17 分化的作用及其机制仍需深入研究。

本研究将BM-MSCs 与CD4+初始T 细胞(CD4+naïve T cell，Th0)体外共培养以观察其对Th0 分化为Th17 的作用，为研究BM-MSCs 调控Th17 分化的机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF 级5 ～6 周龄雄性BALB/c 小鼠，体质量20 ～25 g［中国医学科学院动物所，合格证号:SCXK(京)2009-0007］。

1.2 试剂

小鼠间充质干细胞专用培养基(Stem Cell 公司);小鼠淋巴细胞分离液(达科为公司);CD4+naïve T 细胞分选试剂盒(美天妮公司);RPMI-1640培养基和胎牛血清(Hyclone 公司);CD3 和CD28 抗体包被珠和Trizol(Invitrogen 公司);细胞因子IL-2、IL-6、IL-23 和TGF-β(RD 公司);抗IL-4、IFN-γ 抗体及抗IL-10、PGE2 中和抗体(NA-IL-10、NAPGE2)、ELISA 试剂盒、透膜固定试剂盒(BD 公司);荧光标记的抗小鼠CD4、IL-17 流式抗体(eBioscience 公司);RNA 反转录试剂盒(天根公司);SYBR Green 实时定量PCR 试剂盒(Takara 公司);抗小鼠Rorγt 抗体(CST 公司)。

1.3 方法

1.3.1 小鼠BM-MSCs 的分离培养:取小鼠骨髓，淋巴细胞分离液分离单个核细胞，培养于小鼠间充质干细胞专用培养基，传代培养至第3 代(P3)备用。

1.3.2 小鼠Th0 的分离纯化及与BM-MSCs 的共培养:取小鼠脾脏，筛网上研磨获得单细胞悬液，小鼠淋巴细胞分离液分离总淋巴细胞，试剂盒分选Th0，纯度≥95.0%。分离纯化的Th0 种植于预先铺有BM-MSCs 的孔板中(Th0∶BM-MSCs=10∶1)，培养于RPMI-1640 培养基:含10%胎牛血清，1 mmol/L 谷氨酰胺，0.1 mmol/L β-巯基乙醇，1% 非必需氨基酸，抗CD3 和CD28 抗体包被珠，5 μg/L IL-2，20 μg/L IL-6，5 μg/L TGF-β，10 μg/L IL-23，2 mg/L抗IL-4 中和抗体(NA-IL-4)，2 mg/L NA-IFN-γ，诱导分化3 d。在中和抗体实验中，同型抗体、NAIL-10以及NA-PGE2 的终浓度均为10 mg/L。

1.3.3 流式细胞仪检测CD4+IL-17+细胞:诱导3 d的培养体系中加入佛波酯、离子霉素和莫能霉素处理细胞3 h。收集诱导分化的细胞，用含0.5%牛血清白蛋白的PBS 冰上封闭5 min，加入荧光标记的抗CD4抗体冰上孵育20 min，透膜固定试剂盒处理细胞后，加入荧光标记的抗IL-17 抗体冰上孵育20 min，洗涤后Accuri C6 流式细胞仪检测，CFlow 软件分析。

1.3.4 培养上清细胞因子检测:收集诱导3 d 的培养上清，离心去细胞碎片，采用ELISA 试剂盒检测IL-10、IL-17 和PGE2 的水平。

1.3.5 qRT-PCR 检测Rorγt 的mRNA 水平:Trizol法提取诱导3 d 的细胞总RNA，反转录为cDNA 后，采用SYBR Green 实时定量PCR 试剂盒在IQ5 仪器上检测。Rorγt 上游引物，5'-TGCAAGACTCATCGAC AAGG-3'，下游引物:5'-AGGGGATTCAACATCAGTG C-3';β-actin 上游引物，5'-GAGACCTTCAACACCCC AGCC-3'，下游引物，5'-AATGTCACGCACGATTTCC C-3'。数据处理采用2-△△ct法。

1.3.6 Western blot 检测Rorγt 的蛋白表达:诱导3 d的细胞经RIPA 裂解后提取总蛋白。变性后的蛋白经SDS-PAGE 电泳后，湿转至PVDF 膜，封闭后一抗4 ℃孵育过夜，HRP 标记的二抗室温孵育1 h，ECL 发光检测。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 BM-MSCs 分泌高水平的TGF-β 和IL-6

原代分离的小鼠BM-MSCs 传代培养至P3 时，形态均一，多呈现典型的梭形或多角形(图1A)。ELISA 检测结果表明，P3 BM-MSCs 分泌高水平细胞因子TGF-β 和IL-6，分泌少量促炎因子IFN-γ 和TNF-α，以及抑炎因子IL-10 和PGE2(图1B)。

2.2 BM-MSCs 抑制Th17 的体外诱导分化

由于TGF-β 和IL-6 是诱导Th0 分化为Th17的关键细胞因子，因此我们共培养BM-MSCs 和Th0 以观察BM-MSCs 对Th17 分化的作用。与对照组(无BM-MSCs)相比，BM-MSCs 明显降低CD4+IL-17+Th17 的生成率(图2A)，减少IL-17的分泌量(图2B)，减弱关键转录因子Rorγt 的表达水平(图2C，D)。

2.3 IL-10 和PGE2 介导了BM-MSCs 对Th17 分化的抑制作用

共培养组IL-10 和PGE2 浓度随诱导天数的增加而逐渐上升，明显高于同期对照组(P＜0.05)(图3)。共培养体系中加入NA-IL-10 或NA-PGE2 后，明显提升CD4+IL-17+Th17 的生成率(图4A)，提高IL-17 分泌水平(图4B)，增强Rorγt 的表达量(图4C，D)。而且，同时加入NA-IL-10 和NA-PGE2 能进一步提高Th17 的分化生成率(图4)。因此，共培养体系中IL-10 和PGE2 介导了BM-MSCs 对Th17分化的抑制作用。

图1 小鼠BM-MSCs 形态及细胞因子分泌谱分析Fig 1 Analysis of mouse BM-MSCs morphology and cytokines secretion (±s，n=3)

3 讨论

本实验首先对小鼠BM-MSCs 的细胞因子分泌谱进行了分析，在结果中有两个浓度非常高的细胞因子引起了关注，即TGF-β 和IL-6。由于TGF-β和IL-6 是体外诱导Th0 分化为Th17 必需的细胞因子［8］，由此推测小鼠BM-MSCs 能够促进Th17 的分化成熟。然而，Th0 和BM-MSCs 共培养实验结果显示BM-MSCs 不仅没有促进Th17 的生成，反而起抑制作用。鉴于此，本实验通过细胞因子的中和抗体研究发现，培养体系中的IL-10 和PGE2 能够抑制Th17 的分化生成，其作用机制可能是阻断了TGF-β 和IL-6 活化Th17 分化的信号通路。

图2 BM-MSCs 对Th17 体外分化的影响Fig 2 Effect of BM-MSCs on the Th17 differentiation in vitro(±s，n=3)

图3 共培养体系中IL-10 和PGE2 浓度检测Fig 3 Concentration of IL-10 and PGE2 in the supernatant of co-culture system (±s，n=3)

研究发现，抑炎因子IL-10 和PGE2 在Th17 分化生成的过程中发挥了重要的抑制作用。IL-10能够抑制Th0 分化为Th17［7］，且对Th17 诱发的自身免疫性疾病具有治疗效果［9］。特异性地阻断T细胞中IL-10 的信号通路可以诱发机体IL-17+Th17 数量上升［10］。IL-10 通过活化JAK-STAT5 上调T 细胞中关键转录因子SOCS3 的表达，进而阻断IL-6 的信号通路，从而抑制Th17 分化［7］。此外，PGE2 也能够通过结合EP4 受体而抑制Th17分化［11］。

综上所述，本研究发现虽然BM-MSCs 分泌高水平的TGF-β 和IL-6，有促进Th17 分化的可能，但同时BM-MSCs 也分泌多种抑炎因子，如IL-10和PGE2 等，阻断了IL-6 的信号传导途径，最终导致对Th17 分化的抑制。然而，BM-MSCs 抑制Th17 分化的具体机制仍需深入研究，以期为BM-MSCs 应用于自身免疫性疾病临床治疗奠定基础。

图4 NA-IL-10 和NA-PGE2 对共培养体系中Th17 分化的影响Fig 4 Effect of NA-IL-10 and NA-PGE2 on the Th17 differentiation in the co-culture system (±s，n=3)

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